陸地棉GhWOX4轉錄因子的克隆與生物信息學分析

楊衛軍， 呂有軍，，3， 趙蘭杰， 張永山

(1.安陽工學院，河南安陽 455000； 2.中國農業科學院棉花研究所，河南安陽 455000；3.棉花生物學國家重點實驗室，河南安陽 455000)

WOX(WUSCHEL-related homeobox)基因編碼的轉錄因子家族蛋白在植物的生長發育過程中起著至關重要的作用[1-3]。該家族蛋白含有1段能夠與DNA序列特異結合的由60～66個氨基酸組成的同源異型結構域(home domain，簡稱HD)，具有調控植物干細胞分裂分化、胚發育、側生器官發育、頂端分生組織分化和花器官形成等多種重要功能[4-8]。

不同植物中WOX基因的生物學功能不同，在植物生長發育過程中各自扮演著重要的角色。目前已有報道發現擬南芥基因組中存在15個WOX，各個WOX成員在擬南芥中的功能不同[9]。AtWUS基因與莖尖頂端分生組織發育相關，同時也參與花藥和子房發育過程[10-12]；AtWOX3基因調控擬南芥花瓣的發育[13]，AtWOX13和AtWOX14基因除了參與擬南芥花器官發育外，還影響擬南芥根發育[14]；AtWOX11和AtWOX12基因共同參與外植體根器官發育[15]。水稻基因組中OsWOX1是參與調控不定根生長發育的主要基因，對激活冠狀根的生長發育具有重要作用[16]。此外，在玉米、茄子、番茄、楊樹和高粱等植物中也有關于WOX基因的報道[9，17-18]。棉花是世界上一種重要的經濟作物，其生長發育經歷多個階段。迄今為止，棉花WOX基因在棉花生長發育過程中的功能未知。本研究以中69-11165為試驗材料，采用反轉錄PCR(簡稱RT-PCR)技術克隆GhWOX4基因的cDNA全長序列，并進行生物信息學分析，從基因及蛋白結構、序列比對、系統進化樹等方面分析該基因的結構和功能，為進一步揭示WOX轉錄因子在棉花生長發育過程中的功能奠定了基礎。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1植物材料陸地棉(GossypiumhirsutumL.)中69-11165由中國農業科學院棉花研究所中熟課題組提供，種植在中國農業科學院棉花研究所東場試驗站。從田間植株摘取葉片，用液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱，用于RNA提取。

1.1.2試劑材料RNA提取使用EASYspin Plus植物RNA快速提取試劑盒；焦碳酸二乙酯(DEPC)水、氨芐青霉素(AMP)、異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)大腸桿菌(Escherichiacoli)Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell、KOD-Plus-Neo、pEASY-Blunt Cloning Kit載體、Maker Ⅲ購自寶生物工程(大連)有限公司；反轉錄酶TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix購自北京全式金生物技術有限公司；其他試劑為國產分析純。引物和DNA測序由蘇州金唯智生物科技有限公司合成及完成。

1.2　方法

RNA提取采用EASYspin Plus植物RNA快速提取試劑盒，采用ND1000紫外-可見分光光度計測定D260 nm和D280 nm，計算RNA濃度與純度。用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，保存于-80 ℃備用。按照轉錄酶TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix說明書合成cDNA的第1鏈。

1.2.1棉花GhWOX4基因克隆用擬南芥AtWOX4(AT1G46480)蛋白序列作為探針，在四倍體陸地棉基因組數據庫(http：//www.cottongen.org)中通過Blast比對發現了4個相似性較高的基因Gh_D05G1962、Gh_A05G1768、Gh_D01G1055 和Gh_A01G0998。由于這些基因在棉花中的功能未知，筆者選取其中1個基因Gh_D01G1055作為研究對象，用Primer3設計擴增開放閱讀框的引物(表1)。以棉花葉片cDNA為模板進行PCR擴增，反應體系見表2。

表1　引物序列

表2　PCR擴增反應體系

PCR反應程序：94 ℃預變性5 min；98 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，68 ℃延伸30 s，32個循環；72 ℃延伸10 min。PCR產物用1.2%瓊脂糖電泳進行檢測，回收并純化后連接至Peasy-Blunt Cloning Kit載體，轉化大腸桿菌Trans-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell感受態細胞，挑取單菌落，搖菌，將鑒定正確的質粒送至蘇州金唯智生物科技有限公司測序。

1.2.2GhWOX4基因序列的生物信息學分析用ProtParam(http：//web.expasy.org/protparam/)分析蛋白質的基本理化性質；用在線HNN軟件(https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/)在線預測和分析蛋白質的二級結構組成形式；用EBL-EBI (http：//www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search)和NCBI的BlastP分析氨基酸序列的蛋白質保守區；用IBS 1.0軟件繪制蛋白結構域圖；用SignaIP和WOLF PSORT(http：//psort.hgc.jp/)進行信號肽及亞細胞定位分析；用DNAMAN和Clustal X進行多重序列比對及同源性比對；用MEGA 6.0軟件構建進化樹。

2　結果與分析

2.1　陸地棉GhWOX4基因克隆及序列分析

以擬南芥AtWOX4(AT1G46480)蛋白序列作為探針，在四倍體陸地棉基因組數據庫(http：//www.cottongen.org)中發現了4個相似性較高的基因Gh_D05G1962、Gh_A05G1768、Gh_D01G1055 和Gh_A01G0998。由于這些基因在棉花中的功能未知，筆者選取其中1個基因Gh_D01G1055作為研究對象，其基因組序列全長為1 962 bp，包含長度為654 bp的開放閱讀框(ORF)，以中69-11165棉纖維cDNA為模板，用特異引物GhWOX4F和GhWOX4R進行RT-PCR擴增，經1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得1條600 bp左右的目的條帶(圖1)?；厥漳康钠危瑴y序結果分析顯示擴增獲得的cDNA序列包含長度為657 bp的開放閱讀框，編碼218個氨基酸，與陸地棉Gh_D01G1055序列相似性為99.27%，氨基酸序列一致性為72.40%，表明陸地棉不同種間核酸序列存在一些差異。鑒于棉花中WOX基因尚未見到相關研究報道，將其命名為GhWOX4(NCBI登錄號為KX900572)。

2.2　GhWOX4基因編碼蛋白生物信息學分析

從GhWOX4基因cDNA序列推測GhWOX4蛋白包含218個氨基酸殘基，用ProtParam預測GhWOX4蛋白的基本理化性質。結果表明，GhWOX4蛋白分子式為C1119H1 762N336O311S9，理論分子量為25.19 ku，理論等電點(pI)為10.04，酸性氨基酸(Asp+Glu)有19個，堿性氨基酸(Arg+Lys)有36個；含量最豐富的氨基酸有Leu(9.2%)、Lys(9.2%)和Gly(8.3%)；脂肪系數為63.99，總平均親水性為0.913，不穩定系數為58.61，為不穩定蛋白。采用HNN在線預測分析GhWOX4蛋白二級結構，結果表明，該蛋白主要由α-螺旋、延伸直鏈和無規則卷曲3種結構形式構成，其中α-螺旋包含71個氨基酸，約占32.57%，延伸直鏈包含28個氨基酸，約占12.84%，無規則卷曲包含119個氨基酸，約占39.86%?？梢?，無規則卷曲是該蛋白二級結構的主要組成部分。

為了進一步確定GhWOX4基因是否屬于WOX家族，用EBL-EBI在線分析，結合NCBI 中的BlastP比對，對該基因氨基酸序列進行蛋白質保守區分析，發現GhWOX4基因具有1個同源異型HD(第74位至第147位氨基酸)結構域，該基因屬于典型的WOX家族成員，其位置如圖2所示。采用SignaIP分析GhWOX4蛋白信號肽并預測信號肽位點表明，其平均分小于0.500，最大Y值預測表明GhWOX4蛋白不存在信號肽及切割位點，屬于非分泌蛋白(圖3)。由WOLF PSORT軟件在線預測該蛋白的亞細胞定位情況表明，GhWOX4蛋白主要定位在細胞質和過氧化物酶體上，在線粒體基質中有少量分布。

2.3　GhWOX4蛋白多重序列比對和蛋白進化樹分析

為了解棉花GhWOX4蛋白與其他植物WOX蛋白的親緣關系，用DNAMAN軟件將GhWOX4氨基酸序列與NCBI上公布的其他植物的WOX蛋白進行多重序列比較，結果表明棉花GhWOX4與GenBank中桑樹、番茄等植物的蛋白序列相似性均較低，與擬南芥和可可樹相似性較高，與陸地棉 Gh_D01G1055 氨基酸序列相似性最高，其同源區域主要集中在同源異型HD結構域，進一步確定該基因屬于WOX家族成員，如圖4所示。基于棉花GhWOX4及其他植物WOX基因蛋白序列構建系統進化樹，分析結果表明，棉花GhWOX4基因同陸地棉Gh_D01G1055基因、擬南芥AtWOX4基因、可可樹TcWOX4基因、番茄SlWOX4基因等在同一個進化分支上，屬于WOX4亞家族，如圖5所示。

3　結論與討論

與其他植物相比，棉花中大多數的WOX基因仍未被克隆及研究，本試驗通過RT-PCR技術克隆了陸地棉中1個WOX基因GhWOX4。氨基酸序列分析和蛋白結構域分析表明，GhWOX4基因含有典型的HD同源異型結構域，并且與擬南芥AtWOX4基因、可可樹TcWOX4基因等具有很高的序列同源性，因此屬于WOX基因家族。

系統樹分析表明，GhWOX4基因屬于WOX基因家族的Ⅰ類亞家族成員，與陸地棉中Gh_D01G1055蛋白、擬南芥AtWOX4、可可樹TcWOX4、番茄SlWOX4等在同一個進化分支上。有研究表明，擬南芥AtWOX4基因在維管束形成層和原形成層表達，促進形成層和原形成層分化，影響植物的次生生長[19]。沉默OsWOX4后，水稻莖尖分生組織發育異常，植株矮小，株型異常，葉片失綠發黃[20]。OsWOX4除了參與維管束發育，在花的分生組織和花序中也有很高的表達水平[20]。番茄中過表達SlWOX4，其篩管和導管數量明顯增多[21]。經高溫脅迫處理后番茄通過相應的信號轉導途徑抑制了SlWOX4的表達水平，表明番茄可能通過調節SlWOX4在器官組織中的表達水平來調控其發育進程來響應高溫干旱環境[18]。

通過其他植物WOX4基因功能研究發現，WOX4不僅參與維管束及花器官發育，同時對逆境脅迫具有一定的應答機制。本研究表明，GhWOX4基因屬于WOX轉錄因子家族，具體功能有待利用分子生物學手段進行進一步分析驗證，最終為闡明WOX轉錄因子在棉花生長發育中的功能和機制奠定基礎。

參考文獻：

[1]Laux T，Mayer K F，Berger J，et al. TheWUSCHELgene is required for shoot and floral meristem integrity inArabidopsis[J]. Development，1996，122(1)：87-96.

[2]Haecker A，Grosshardt R，Geiges B，et al. Expression dynamics ofWOXgenes mark cell fate decisions during early embryonic patterning inArabidopsisthaliana[J]. Development，2004，131(3)：657-668.

[3]van der Graaff E，Laux T，Rensing S A. The WUS homeobox-containing (WOX) protein family[J]. Genome Biology，2009，10(12)：248.

[4]王占軍，陳金慧，施季森. 植物干細胞中WUS/CLV反饋調控機制的研究進展[J]. 林業科學，2011，47(4)：159-165.

[5]Yadav R K，Reddy G V. WUSCHEL protein movement and stem cell homeostasis[J]. Plant Signaling & Behavior，2012，7(5)：592-594.

[6]高麗，孫祎敏，邵鐵梅，等. 植物WUSCHEL-related homeobox(WOX)家族研究進展[J]. 生物技術通報，2015，34(5)：7-12.

[7]王俞程，何瑞萍，彭獻軍，等. WOX轉錄因子家族研究進展[J]. 草業科學，2015，32(5)：760-769.

[8]Ueda M，Zhang Z，Laux T，et al. Transcriptional activation ofArabidopsisaxis patterning genesWOX8/9 links zygote polarity to embryo development[J]. Developmental Cell，2011，20(2)：264-270.

[9]Zhang X，Zong J，Liu J，et al. Genome-wide analysis ofWOXgene family in rice，sorghum，maize，Arabidopsisand poplar[J]. Journal of Integrative Plant Biology，2010，52(11)：1016-1026.

[10]Gross-Hardt R，Lenhard M，Laux T. WUSCHEL signaling functions in interregional communication duringArabidopsisovule development[J]. Genes & Development，2002，16(9)：1129-1138.

[11]Deyhle F，Sarkar A K，Tucker E J，et al.WUSCHELregulates cell differentiation during anther development[J]. Developmental Biology，2007，302(1)：154-159.

[12]Gallois J L，Nora F R，Mizukami Y，et al.WUSCHELinduces shoot stem cell activity and developmental plasticity in the root meristem[J]. Genes & Development，2004，18(4)：375-380.

[13]Vandenbussche M，Horstman A，Zethof J，et al. Differential recruitment ofWOXtranscription factors for lateral development and organ fusion in petunia andArabidopsis[J]. Plant Cell，2009，21(8)：2269-2283.

[14]Deveaux Y，Toffano-Nioche C，Claisse G，et al. Genes of the most conserved WOX clade in plants affect root and flower development inArabidopsis[J]. BMC Evolutionary Biology，2008，8(1)：291.

[15]Liu J C，Sheng L H，Xu Y Q，et al.WOX11 and 12 are involved in the first-step cell fate transition during de novo root organogenesis inArabidopsis[J]. The Plant Cell，2014，26(3)：1081-1093.

[16]Zhao Y，Hu Y F，Dai M Q，et al. The WUSCHEL-related homeobox geneWOX11 is required to activate shoot-borne crown root development in rice[J]. The Plant Cell，2009，21(3)：736-748.

[17]韓洪強，劉楊，周子路，等. 茄子SmWOX13基因的克隆、亞細胞定位及序列分析[J]. 上海交通大學學報(農業科學版)，2015，33(2)：1-8，17.

[18]李曉旭，劉成，李偉，等. 番茄WOX轉錄因子家族的鑒定及其進化、表達分析[J]. 期刊名稱缺失，2016，38(5)：444-460.

[19]Hirakawa Y，Kondo Y，Fukuda H. TDIF peptide signaling regulates vascular stem cell proliferation via theWOX4 homeobox gene inArabidopsis[J]. The Plant Cell，2010，22(8)：2618-2629.

[20]Ohmori Y，Tanaka W，Kojima M，et al.WUSCHEL-RELATEDHOMEOBOX4 is involved in meristem maintenance and is negatively regulated by the CLE geneFCP1 in rice[J]. The Plant Cell，2013，25(1)：229-241.

[21]Ji J B，Strable J，Shimizu R，et al.WOX4 promotes procambial development[J]. Plant Physiology，2010，152(3)：1346-1356.