骨髓間充質干細胞移植對周圍神經損傷后施旺細胞的影響

邱超　鄭亞妮　許碩貴

周圍神經損傷是臨床常見疾患，隨著神經橋接和自體神經移植等方法的應用，其修復取得了一定進展，但損傷后的功能恢復仍不盡如人意。其中，影響神經再生和功能修復的主要因素是神經遠側段施旺細胞支持神經再生的能力，故圍繞促進施旺細胞再生及存活的研究，成為周圍神經損傷修復研究的熱點問題。

間充質干細胞 （Mesenchymal stem cells，MSCs）具有自我更新和多向分化能力，是臨床細胞治療中極具吸引力的干細胞資源，可由骨髓、脂肪、臍血和其他成體組織分離獲得[1-2]。前期研究發現，MSC植入后可治療神經損傷和退化[3-5]。其中，BMSCs發現較早，具有來源豐厚、獲取簡單、增殖力強等諸多優點，是常用的神經組織工程種子細胞[6]。本研究采用SD大鼠來源的BMSCs，將其植入大鼠坐骨神經損傷處，觀察其對神經損傷后施旺細胞的影響。

1　材料和方法

1.1　實驗動物和材料

雄性SD大鼠，3周齡2只，體質量40～50 g；6周齡9只，體質量180～200 g（第二軍醫大學動物中心）。DMEM/F12培養基（廣州賽業生物科技有限公司）；胎牛血清（FBS）和 1%青霉素/鏈霉素（美國Gibco公司）；小鼠抗S100β抗體 （美國Abcam公司）；山羊抗小鼠IgG二抗 （美國Invitrogen公司）；DAPI和RIPA（武漢谷歌生物科技有限公司）。

1.2　大鼠BMSCs的分離和培養

將2只3周齡SD大鼠經脫臼處死后，置于75%乙醇中消毒5 min，取雙側股骨，15 m L PBS沖洗骨髓腔，收集沖洗液，并用70μm細胞篩網過濾，將濾液移至15 m L離心管中，1 500 r/min離心5 min，用培養基（DMEM/F12+10%FBS+1%青霉素/鏈霉素）重懸后種植于培養瓶中，置37℃、5%的CO2培養箱中培養。24 h后全換液，PBS沖洗3次，去除未貼壁細胞。當細胞達80%融合時，按1∶2傳代，傳至第4代后備用。

1.3　坐骨神經橫斷損傷模型的制備

9只6周齡SD大鼠，其中3只為正常組，僅分籠正常飼養即可。其余6只腹腔麻醉后，暴露坐骨神經，在距坐骨結節遠側4 mm處切斷，神經斷端曠置，將肌肉和皮膚縫合。2周后即成為神經損傷模型。術后常規抗感染治療，正常分籠飼養。

1.4　BMSCs移植

將損傷模型分為BMSCs組和PBS組，每組3只，損傷2周后進行細胞移植。腹腔麻醉，暴露橫斷損傷后的坐骨神經。BMSCs組用10μL的 Hamilton微量注射器，向損傷神經遠側段注入BMSCs，細胞濃度2×105cells/μL，總量 3 μL，分 3點注入。 PBS 組，即對照組，同法注入等量PBS。然后縫合肌肉和皮膚，術后進行抗感染治療，正常分籠飼養，6周后取材。

1.5　HE染色和免疫熒光染色

將厚度為5μm的坐骨神經石蠟切片，常規HE染色，中性樹膠封片，鏡下觀察拍照。

坐骨神經石蠟切片 （5μm厚），4%多聚甲醛固定 10 min，PBS清洗 3遍，0.3%Triton-X-100打孔10 min，5%驢血清封閉 20 min，孵育一抗（S-100β，1∶400），4℃過夜， 二抗室溫孵育1.5 h，PBS清洗3遍，每次 5 min，DAPI染核 5 min，PBS 清洗 3 遍，每次5 min。抗熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.6　統計學處理

以SPSS21.0統計學軟件進行分析，計量數據以（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1　BMSCs形態特征

BMSCs呈典型長梭形貼壁生長，兩端有較長突起，胞核為卵圓形，均勻分布。細胞從原代（圖1A）至第4代形態變化不明顯（圖1B）。我們的前期實驗已對同樣方法獲得的細胞進行了鑒定，其對于CD44、CD90的表達高達90%，而CD34、CD45的表達則為陰性，證實其為BMSCs[7]。

圖1　BMSCs的形態特征（標尺=100μm）Fig.1　Morphology of BMSCs(Scale bar=100μm)

2.2　HE染色觀察

HE染色可見正常坐骨神經軸突及雪旺細胞排列整齊，施旺細胞完整且結構清晰，并間斷形成有規律的迂曲（圖2 A）。坐骨神經損傷后有些軸突腫脹、軸突及雪旺細胞破潰、排列雜亂；BMSCs組相較于PBS組，施旺細胞數量明顯較多，且排列較均勻，連接較緊密（圖2 C）；PBS組細胞排列稀疏，分布混亂（圖 2 B）。

圖2　損傷坐骨神經遠側段HE染色觀察（標尺=50μm）Fig.2　Morphological observation of the distal of injured sciatic nerve by HE staining(Scale bar=50μm)

2.3　免疫熒光染色觀察

結果顯示，縱切面（圖3 A-C）施旺細胞在正常坐骨神經組織中，平行有序致密排列。而損傷后的組織中，施旺細胞數量變少，且出現破碎和中斷，排列間隙變大。與PBS組相比，BMSC s組的細胞結構更清晰，細胞數量更多，細胞完整度更高。橫切面上（圖3 D-F）正常神經的施旺細胞呈圓形，排列均勻。PBS組細胞破碎，出現大量零星的S-100β的表達，而在BMSC組中，完整的施旺細胞數量顯著增多 （圖3 G），與正常組的施旺細胞形態更為接近。實驗結果提示，植入的BMSCs能促進施旺細胞的存活或再生，促進細胞生成更規則和完整的形態。

圖3　損傷坐骨神遠側段免疫熒光染色觀察（A-C：標尺=10μm；D-F：標尺=25μm）Fig.3　Morphological observation of the distal of injured sciatic nerve by immunofluorescence staining(A-C:Scale bars=10μm;D-E:Scale bars=25μm)

3　討論

周圍神經再生速度很慢，過程復雜，影響其再生和功能修復的主要因素涉及3個方面：神經元的再生能力；損傷神經遠側段施旺細胞支持神經再生的能力；靶器官接受神經再支配能力。而其中導致神經再生受阻的主要原因是損傷神經遠側段施旺細胞對神經再生的支持[8-9]。

神經損傷后，其遠側段失神經施旺細胞基因表達迅速發生改變，細胞表型由髓鞘型轉變為生長支持型。施旺細胞開始分裂、增殖，并在1周時達到高峰，增殖的施旺細胞在基膜內形成Büngner帶，為再生軸突提供營養支持和物理保護功能[10-11]。如果長期得不到近側段軸突的再接觸，施旺細胞會萎縮、塌陷和凋亡。施旺細胞上調炎性因子、神經營養因子以及黏附分子的表達，同時會募集巨噬細胞于損傷處，以清除損傷軸突及髓鞘殘骸，為軸突再生提供合適的微環境[10]。軸突再生后，施旺細胞轉變為髓鞘型，包繞軸突形成髓鞘，支持后期神經功能的恢復[12]。神經末端的施旺細胞引導再生軸突方向，使其準確找到靶器官。施旺細胞通過以上多種方式支持周圍神經的再生和功能恢復。

基于損傷遠側段失神經施旺細胞是維持神經再生的關鍵因素，施旺細胞替代治療和組織工程的研究成為周圍神經損傷修復的熱點問題[13-15]。有研究將施旺細胞或將干細胞植入體內，觀察移植后軸突再生和功能恢復情況[16-17]。但是，卻少有報道觀察干細胞植入后對宿主施旺細胞的保護及促再生作用。本實驗重點觀察BMSCs移植后施旺細胞的變化，探究其是否對宿主施旺細胞有保護和促進再生的作用，以進一步探討干細胞促進周圍神經再生的作用機制。

本實驗檢測了損傷區域BMSCs對施旺細胞的保護和再生作用，BMSC s組相較于PBS組有更好的細胞形態和更多的細胞數量，而且HE染色也同時觀察到神經纖維的排列更加整齊有序，神經恢復情況更好。在免疫熒光染色中，可見PBS組中施旺細胞大多破碎分布不均，而BMSC組中完整細胞數量更多，結構更加清晰。說明BMSCs細胞的接觸對長期失神經的施旺細胞有保護功能，使其維持正常細胞形態，在損傷8周后，施旺細胞依然能夠保持其正常的細胞結構并發揮其支持神經再生的功能。

上述結果說明，BMSCs植入坐骨神經后除了有替代功能外，還可以通過保護施旺細胞，進而促進周圍神經的再生和功能恢復。

[1]Zou JP,Huang S,Pen g Y,et al.Mesenchymal stem cells/multipotent mesenchymal stromal cells(MSCs)：potential role in healing cutaneous chronic wounds[J].Int JLow Extrem Wounds,2012,11(4)：244-253.

[2]Du WJ,Chi Y,Yang ZX,et al.Heterogeneity of proangiogenic features in mesenchymal stem cells derived from bone marrow,adipose tissue,umbilical cord,and placenta[J].Stem Cell Res Ther,2016,7(1)：163.

[3]Huang T,He D,Kleiner G,et al.Neuron-like differentiation of adipose-derived stem cells from infant piglets in vitro[J].J Spinal Cord Med,2007,30(Suppl 1)：S35-S40.

[4]Alexanian AR,Fehlings MG,Zhang Z,et al.Transplanted neurally modified bone marrow-derived mesenchymal stem cells promote tissue protection and locomotor recovery in spinal cord injured rats[J].Neurorehabil Neural Repair,2011,25(9)：873-880.

[5]Spejo AB,Carvalho JL,Goes AM,et al.Neuroprotective effects of mesenchymal stem cells on spinal motoneurons following ventral root axotomy：synapse stability and axonal regeneration[J].Neuroscience,2013,250：715-732.

[6]Kern S,Eichler H,Stoeve J,et al.Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow,umbilical cord blood,or adipose tissue[J].Stem Cells,2006,24(5)：1294-1301.

[7]Zheng Y,Huang C,Liu F,et al.Comparison of the neuronal differentiation abilities of bone marrowderived and adipose tissue-derived mesenchymal stem cells[J].Mol Med Rep,2017,16(4)：3877-3886.

[8]Sulaiman OA,Gordon T.Effects of short-and long-term Schwann cell denervation on peripheral nerve regeneration,myelination,and size[J].Glia,2015,32(3)：234-246.

[9]Sulaiman OA,Gordon T.Role of chronic Schwann cell denervation in poor functional recovery after nerve injuries and experimental strategies to combat it[J].Neurosurgery,2009,65(4 Suppl)：A105-A114.

[10]Hall SM.The biology of chronically denervated Schwann cells[J].Ann N Y Acad Sci,1999,883：215-233.

[11]Corfas G,Velardez MO,Ko CP,et al.Mechanisms and roles of axon-Schwann cell interactions[J].J Neurosci,2004,24(42)：9250-9260.

[12]Bosse F.Extrinsic cellular and molecular mediators of peripheral axonal regeneration[J].Cell Tissue Res,2012,349(1)：5-14.

[13]Fansa H,Keilhoff G.Comparison of different biogenic matrices seeded with cultured Schwann cells for bridging peripheral nerve defects[J].Neurol Res,2004,26(2)：167-173.

[14]Fox IK,Schwetye KE,Keune JD,et al.Schwann-cell injection of cold-preserved nerve allografts[J].Microsurgery,2005,25(6)：502-507.

[15]Arino H,Brandt J,Dahlin LB.Implantation of Schwann cells in rat tendon autografts as a model for peripheral nerve repair：long term effects on functional recovery[J].Scand J Plast Reconstr Surg Hand Surg,2008,2(6)：281-285.

[16]Walsh S,Midha R.Practical considerations concerning the use of stem cells for peripheral nerve repair[J].Neurosurg Focus,2009,26(2)：E2.

[17]Walsh SK,Kumar R,Grochmal JK,et al.Fate of stem cell transplants in peripheral nerves[J].Stem Cell Res,2012,8(2)：226-238.