結(jié)締組織生長(zhǎng)因子在大鼠糖尿病心肌病中的作用機(jī)制

梁媛媛

(黔西南民族職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州　興義　562400)

結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)是近幾年發(fā)現(xiàn)的一種致纖維化細(xì)胞因子，其對(duì)于成纖維細(xì)胞活化具有顯著效果，并且可促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)形成積聚效果〔1,2〕。有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)〔3〕，糖尿病患者出現(xiàn)充血性心力衰竭的原因與糖尿病心肌病具有顯著相關(guān)性，且糖尿病心肌病作為糖尿病患者的常見并發(fā)癥，其早期主要特征性表現(xiàn)為舒張功能異常，導(dǎo)致糖尿病心肌病患者心肌功能顯著下降的主要因素為間質(zhì)纖維化。本研究擬分析糖尿病心肌病產(chǎn)生過程中CTGF水平的變化情況及其與心肌纖維化、細(xì)胞外基質(zhì)積聚的相關(guān)性。

1　資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、儀器與試劑選擇56只雄性SD大鼠，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各28只，體質(zhì)量(BW)220～250 g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。鏈脲佐菌素(美國(guó)Sigma公司，批號(hào)20120736)；枸櫞酸緩沖液(無錫福祈制藥有限公司，批號(hào)20120814)；戊二醛(湖南爾康湘藥制藥有限公司；批號(hào)20130110)；乙醇(新鄉(xiāng)市先豐醫(yī)藥新材料有限公司，批號(hào)20130209)；丙酮(廣東逸舒制藥有限公司，批號(hào)20121210)；硝普鈉(北京世橋生物制藥有限公司，批號(hào)20131108)。高速冷凍微量離心機(jī)(美國(guó)貝克曼公司)；紫外可見分光光度儀(美國(guó)BIO-RAD公司)；樂康醛血糖測(cè)定儀(麥克奧迪公司)。

1.2建模實(shí)驗(yàn)組給予腹腔注射1%鏈脲佐菌素，55 mg/kg，在注射72 h后使用血糖儀檢測(cè)大鼠尾靜脈血糖水平，以大鼠血糖水平在16.7 mmol/L及其以上為糖尿病模型標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)照組給予大鼠枸櫞酸緩沖液注射，55 mg/kg。

1.3觀測(cè)指標(biāo)及方法于糖尿病成模后的第4、8、12周從兩組中隨機(jī)各選取5只大鼠進(jìn)行觀測(cè)：常規(guī)方法測(cè)定其空腹血糖(FPG)水平；空腹稱量BW后將大鼠處死，取左心室心尖部稱完質(zhì)量后放入液氮中保存，取大鼠心臟剪取大血管，抽凈血液后測(cè)量大鼠心臟質(zhì)量(HW)，然后去除心房和右心室游離壁，檢測(cè)左心室質(zhì)量(LVM)，并計(jì)算心體比(HW/BW)及左室質(zhì)量指數(shù)(LVMI)，H/B=HW/BW，LVMI=LVM/BW。采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法測(cè)心肌CTGF、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1、纖維連接蛋白(FN)及Ⅲ型膠原(Col Ⅲ)基因表達(dá)，并分析心肌CTGF與TGF-β1、FN、Col Ⅲ的相關(guān)性。于糖尿病成模后第12周，采用電鏡觀察兩組大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)變化〔4〕，采用光鏡觀察兩組大鼠冠狀動(dòng)脈變化〔5〕。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS18.0軟件，兩組計(jì)量資料比較行配對(duì)t檢驗(yàn)，多組計(jì)量資料比較行方差分析；用線性相關(guān)分析法分析各指標(biāo)的相關(guān)性。

2　結(jié)　果

2.1兩組FPG、H/B及LVMI變化情況糖尿病成模后第4周時(shí)，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組BW水平較低，H/B、LVMI及FPG水平較高(P<0.05)，HW及LVM水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。第4、12周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組BW水平低于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組HW、LVM、H/B、LVMI及FPG水平均高于對(duì)照組(P<0.05)。對(duì)照組不同時(shí)間的HW、LVM、H/B、LVMI及FPG水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)組隨著病程時(shí)間的增加，BW、HW、LVM、H/B、LVMI水平的增長(zhǎng)明顯(P<0.05)。見表1。

表1　兩組FPG、H/B及LVMI變化情況比較

與對(duì)照組比較：1)P<0.05；與4 w時(shí)比較：2)P<0.05；與8 w時(shí)比較:3)P<0.05，下表同

2.2心肌超微結(jié)構(gòu)及冠狀動(dòng)脈變化糖尿病成模后第12周透射電鏡觀察顯示：實(shí)驗(yàn)組大鼠心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂，肌節(jié)較少且雜亂無章，存在肌纖維收縮帶；線粒體不整齊，體積較小，數(shù)量較少，存在嵴斷裂、融合現(xiàn)象，并且有較多糖原顆粒沉積，脂滴增加；間質(zhì)和血管周圍膠原纖維數(shù)量較多，毛細(xì)血管基底膜輕度增厚；而對(duì)照組大鼠未出現(xiàn)以上情況。光鏡觀察顯示：兩組冠狀動(dòng)脈開口的大小及血管壁厚度相似。

2.3兩組大鼠CTGF、FN、ColⅢ及TGF-β1 mRNA表達(dá)水平比較實(shí)驗(yàn)組各檢測(cè)時(shí)間CTGF、FN、ColⅢ及TGF-β1 mRNA表達(dá)均高于對(duì)照組(均P<0.05)；對(duì)照組各檢測(cè)時(shí)間CTGF、FN、ColⅢ及TGF-β1 mRNA表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。實(shí)驗(yàn)組隨著病程時(shí)間增加，CTGF、FN、ColⅢ及TGF-β1 mRNA表達(dá)增長(zhǎng)明顯(均P<0.05)。見表2。

表2　兩組CTGF、FN、ColⅢ及TGF-β1 mRNA表達(dá)對(duì)比

2.4實(shí)驗(yàn)組各指標(biāo)相關(guān)性分析GTGF mRNA表達(dá)與TGF-β1、FN、ColⅢ mRNA表達(dá)均呈正相關(guān)(r=0.762、0.935、0.872，均P<0.01)。 TGF-β1 mRNA表達(dá)與FN、ColⅢ mRNA表達(dá)亦呈正相關(guān)(r=0.735、0.637，均P<0.01)。

3　討　論

糖尿病心肌病是一種發(fā)病率較高、危害較大的糖尿病并發(fā)癥，會(huì)引發(fā)機(jī)體代謝紊亂，導(dǎo)致微血管病變，從而引發(fā)心肌廣泛性灶性壞死，最終發(fā)展為心力衰竭、心律失常，嚴(yán)重情況下會(huì)導(dǎo)致患者死亡。目前研究證實(shí)〔6，7〕，糖尿病心肌病的產(chǎn)生可能與機(jī)體心肌細(xì)胞鈣運(yùn)轉(zhuǎn)缺陷、心肌細(xì)胞代謝紊亂、心肌間質(zhì)纖維化、冠狀動(dòng)脈微血管病變及心臟自主神經(jīng)病變等有關(guān)。另有研究結(jié)果表明〔8〕，心肌細(xì)胞外基質(zhì)聚集會(huì)導(dǎo)致心臟間質(zhì)、局部微瘢痕及血管周圍纖維化的產(chǎn)生，從而引發(fā)機(jī)體出現(xiàn)心臟肥厚、心功能降低及心室僵硬現(xiàn)象，最終會(huì)引發(fā)心力衰竭，也是導(dǎo)致糖尿病心臟性死亡不可忽略的因素。CTGF是一種致纖維化細(xì)胞因子，對(duì)成纖維細(xì)胞活化和促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)形成積聚的效果顯著，與糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生機(jī)制有明顯的相關(guān)性。

本研究顯示，大鼠糖尿病病程4 w開始存在心肌肥大和左室肥厚情況，且隨著病程的延長(zhǎng)，心肌肥大和左室肥厚程度逐漸加重，與習(xí)雪峰等〔9〕研究結(jié)果一致。成模后第12周透射電鏡觀察顯示實(shí)驗(yàn)組大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)變化顯著，而對(duì)照組大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)變化不明顯，光鏡觀察實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組大鼠冠狀動(dòng)脈開口大小及血管壁厚度相似，未見無冠狀動(dòng)脈病變發(fā)生。說明鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病SD大鼠在12 w時(shí)糖尿病心肌病已經(jīng)形成。本研究還顯示，糖尿病心肌的CTGF、FN、ColⅢ及TGF-β1 mRNA均呈高表達(dá)狀態(tài)，隨著病程的進(jìn)展表達(dá)水平增加，提示CTGF等參與了糖尿病心肌病的形成與進(jìn)展，與房慧娟等〔10，11〕研究基本相符。CTGF的高表達(dá)狀態(tài)與FN、ColⅢ的高表達(dá)有關(guān)，與段濱紅等〔12〕研究一致。

CTGF中含有大量半胱氨酸，能夠有效提高FN、ColⅢ等細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生量，在器官纖維化時(shí)，CTGF表達(dá)增加是必然現(xiàn)象，CTGF長(zhǎng)時(shí)間過度表達(dá)可有效幫助纖維化的產(chǎn)生和不斷發(fā)展〔13〕。CTGF可不用憑借TGF-β1的活性而介導(dǎo)心臟纖維化及心功能不全。纖維化組織產(chǎn)生時(shí)，TGF-β1起到誘導(dǎo)纖維化的作用，CTGF會(huì)有效促進(jìn)纖維化進(jìn)一步形成，CTGF的形成存在自身反饋調(diào)節(jié)的機(jī)制〔14〕。相比于TGF-β1，CTGF的表達(dá)更持久，并且與細(xì)胞外基質(zhì)積聚的關(guān)系更為緊密。同時(shí)TGF-β1存在雙面性，其在正常表達(dá)過程中可有效避免抑制炎癥的發(fā)生及細(xì)胞增殖；而在過度表達(dá)后會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)積聚及機(jī)體組織器官纖維化。如果對(duì)TGF-β1的正常表達(dá)進(jìn)行干擾后會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)失控等副作用的可能，而CTGF僅介導(dǎo)TGF-β1的負(fù)面效應(yīng)〔15〕。

綜上所述，糖尿病心肌CTGF呈高表達(dá)狀態(tài)，且隨病程的進(jìn)展表達(dá)水平增高，CTGF參與了糖尿病心肌病的形成與進(jìn)展，有望成為治療糖尿病心肌病的新靶點(diǎn)。然而以CTGF為靶點(diǎn)治療糖尿病心肌病的臨床療效及安全性有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

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