過表達N-Myc下游調節基因3促進Hela宮頸癌細胞增殖和遷移

符　婕　白　雪　楊琳紅　陳立平　魏　宏　李　晶　齊亞靈　王偉群

(佳木斯市中心醫院婦產科，黑龍江　佳木斯　154002)

N-Myc下游調節基因(NDRG)家族是原癌基因N-myc下游調控基因，共包括4個成員，分別為NDRG1、NDRG2、NDRG3 和NDRG4。近年來的研究表明，NDRG成員在腫瘤的發生與演進中發揮重要的作用，并且發現同一成員可同時具有腫瘤促進和抑制雙重作用，其原因可能是由各成員的組織特異性所決定的〔1〕。本實驗研究NDRG3對Hela細胞增殖、遷移的作用及機制。

1　材料與方法

1.1實驗細胞及主要材料Hela宮頸癌細胞株購自中科院上海細胞庫；RPMI1640 培養基及胎牛血清(FBS)購自美國GIBCO公司；山羊抗NDRG3多克隆抗體購置加拿大SANTA CRUZ公司；細胞遷移(Transwell)小室、細胞培養皿、培養板購置美國CORNING公司；趨化因子CXC配體(L)5酶聯免疫吸附(ELISA)及細胞計數試劑(CCK)-8試劑盒購自武漢博士德公司。

1.2細胞轉染及鑒定將Hela細胞接種于6孔板中(6×105個/孔)，細胞所用培養基為2 ml含10% FBS、無雙抗的RPMI1640；將孔板置于37℃、5% CO2培養箱中培養至細胞密度達到80%后，更換上述培養基；依照Lipofectamine 2000轉染試劑說明書進行轉染；48 h后加入遺傳霉素(G418)進行篩選(終濃度為4 ng/μl)；行Western 印跡實驗檢測轉染效率。

1.3CCK-8實驗將親代(Parental)、空質粒轉染(Mock)、穩定轉染(Overexpression)Hela細胞株分別接種于96孔板中(2×103個/孔)，細胞所用培養基為100 μl含10% FBS及雙抗的RPMI1640；將孔板置于37℃、5% CO2培養箱中培養；每隔24 h進行CCK-8實驗。CCK-8實驗具體操作：(1)向每孔中加入10 μl CCK-8試劑；(2)37℃培養箱中培養2 h；(3)酶標儀讀取450 nm處吸光度值。

1.4Transwell實驗將上述3株細胞分別接種于Transwell小室中(1×104個/室)，所用培養基為100 μl無FBS的RPMI1640；將小室置于24孔板各孔，孔板中培養基為600 μl含10%FBS的RPMI1640；將孔板置于37℃培養箱中培養；12 h和24 h后用脫脂棉簽擦拭小室內表面以去除沒有遷移的細胞；結晶紫染色，沖洗后進行拍照、計數。

1.5ELISA實驗將上述3株細胞分別接種于6孔板中(1.5×105個/孔)，所用培養基為1 ml含10% RPMI1640；將細胞在37℃培養箱中培養48 h后收集培養基上清，按試劑盒操作步驟檢測CXCL5濃度。

1.6統計分析采用SPSS19.0軟件進行q檢驗。

2　結　果

2.1穩定轉染細胞的鑒定Parental，Mock和Overexpression三組細胞的NDRG3相對表達量分別為0.682±0.179，0.783±0.137和1.312±0.159。Overexpression與Parental、Mock比較差異有統計學意義(P<0.01)，由此說明已經構建了NDRG3穩定轉染細胞株。

2.2過表達NDRG3促進Hela細胞的增殖細胞培養至72 h和96 h，Overexpression組吸光度值明顯高于Parental和Mock組(P<0.05或<0.01)，由此可見，過表達NDRG3可促進Hela細胞的增殖能力。見表1。

2.3過表達NDRG3促進Hela細胞的遷移細胞培養至24 h和36 h，Overexpression組遷移細胞數明顯多于Parental和Mock組(P<0.05)，由此可見，過表達NDRG3可促進Hela細胞的遷移能力。見表2。

表1　過表達NDRG3促進Hela細胞的增殖吸光度,n=8)

與Parental和Mock比較：1)P<0.05，2)P<0.01;表2同

表2　過表達NDRG3促進Hela細胞的遷移細胞數，n=6)

2.4過表達NDRG3促進Hela細胞分泌CXCL5Parental和Mock組CXCL5分泌性蛋白量分別為(86.36±7.73)ng/ml和(87.12±7.39)ng/ml，兩者顯著低于Overexpression組〔(108.58±8.09)ng/ml,P<0.01〕。

3　討　論

NDRG蛋白家族4個成員(NDRG1、NDRG2、NDRG3和NDRG4)的氨基酸同源性高達57%～65%，它們最顯著特征是都具有一個NDR和一個α/β 水解酶折疊區域。在功能上，NDRG家族成員可參與細胞增殖、分化、發育和應激反應等多種過程，同時亦在腫瘤中發揮重要作用〔1〕。研究表明，NDRG1在多種腫瘤如前列腺癌、乳腺癌、結腸癌、神經膠質瘤和食管鱗狀細胞癌具有轉移抑制功能〔2〕。然而，特異性沉默肝癌細胞NDRG1的表達，可抑制細胞增殖、侵襲和裸鼠移植瘤的生長，由此可見，NDRG1在肝癌中具有腫瘤促進功能〔3〕。Deng等〔4〕報道轉染NDRG2的腫瘤細胞會發生增殖、侵襲和轉移能力下降的現象。與NDRG1一樣，NDRG4也具有腫瘤促進和抑制的雙重作用，一方面在結腸直腸癌中其可減少癌細胞的增殖和侵襲〔5〕；而另一方面其又可促進成膠質細胞瘤的增殖與存活〔6〕。

本實驗研究表明，過表達NDRG3基因在顯著促進Hela細胞的增殖和遷移的同時，還上調Hela的分泌性趨化因子CXCL5蛋白水平，該結果與我們先前在前列腺癌中的研究結果相一致〔7〕。同樣，我們在之前的研究也顯示CXCL5與NDRG3一樣，均可促進前列腺癌細胞的增殖〔8〕，提示NDRG3/CXCL5軸在腫瘤中的重要作用。在腫瘤微環境中，腫瘤細胞、間質細胞、炎性細胞等多種細胞可分泌趨化因子經自分泌和旁分泌途徑參與腫瘤的惡性轉化和發展進程〔9〕。基于此，本研究推斷，在宮頸癌中上調NDRG3表達可促進腫瘤細胞分泌CXCL5進入腫瘤微環境，作為微環境中的一種活性成分，CXCL5進而經與腫瘤細胞，間質細胞、炎性細胞上的CXCL5受體(CXCR2)作用而發揮促癌功能。

1Melotte V，Qu X，Ongenaert M，etal.The N-myc downstream regulated gene (NDRG) family：diverse functions，multiple applications〔J〕.FASEB J，2010；24(11)：4153-66.

2Yang X，An L，Li X.NDRG3 and NDRG4，two novel tumor-related genes〔J〕.Biomed Pharmacother,2013；67(7)：681-4.

3Yan X，Chua MS，Sun H，etal.N-Myc down-regulated gene 1 mediates proliferation，invasion，and apoptosis of hepatocellular carcinoma cells〔J〕.Cancer Lett，2008；262 (1)：133-42.

4Deng Y，Yao L，Chau L，etal.N-Myc downstreamregulated gene 2 (NDRG2) inhibits glioblastoma cell proliferation〔J〕.Int J Cancer，2003；106(3)：342-7.

5Melotte V，Lentjes MH，van den Bosch SM，etal.N-Myc downstream regulated gene 4 (NDRG4)：a candidate tumor suppressor gene and potential biomarker for colorectal cancer〔J〕.J Natl Cancer Inst，2009；101(13)：916-27.

6Schilling SH，Hjelmeland AB，Radiloff DR，etal.NDRG4 is required for cell cycle progression and survival in glioblastoma cells〔J〕.J Biol Chem，2009；284 (37)：25160-9.

7Wang W，Li Y，Li Y，etal.NDRG3 is an androgen regulated and prostate enriched gene that promotes in vitro and in vivo prostate cancer cell growth〔J〕.Int J Cancer，2009；124(3)：521-30.

8齊亞靈，王偉群，張建華，等.CXC 趨化因子配體 5 對前列腺癌細胞生長的作用〔J〕.中國老年學雜志，2014；34(11)：3035-6.

9Cheng ZH，Shi YX，Yuan M，etal.Chemokines and their receptors in lung cancer progression and metastasis〔J〕.J Zhejiang Univ Sci B，2016；17(5)：342-51.