miR-146a基因單核苷酸多態性位點多態性與老年癲癇易感性的相關性及作用機制

尹曉剛　張輝芳　李富強

(南陽醫學高等專科學校第一附屬醫院神經內科，河南　南陽　473058)

癲癇是一種常見的神經系統慢性疾病，主要是指多種病因造成腦細胞群異常的超同步化放電而引起的具有發作性、突然性和暫時性特征的腦功能紊亂，但其具體發病機制目前尚不完全清楚〔1,2〕。癲癇在我國的發病率較高，大約有1 000萬的患者，臨床上一般多采用抗癲癇藥物(AEDs)進行治療，治療效果不理想，應與癲癇患者的易感性和耐藥性有關〔3,4〕。研究表明〔5〕，miRNA(miR)-146a可能是癲癇發生的重要調控因子，其在炎癥信號通路中發揮著重要的作用，但目前關于miR-146a基因單核苷酸多態性(SNP)位點rs57095329基因多態性與癲癇易感性關系的研究卻較少。本研究探討并分析rs57095329位點多態性與癲癇易感性的關系。

1　資料與方法

1.1一般資料見表1。2012年2月至2016年12月南陽醫學高等?？茖W校第一附屬醫院老年癲癇患者75例為病例組，納入標準：①年齡≥60歲；②均經腦電圖確診；③患者及家屬均簽署知情同意書。排除標準：①合并有肝、腎等重要臟器疾病；②有認知功能障礙等精神疾病。同時按照1∶2配對選取150例健康志愿者為對照組，兩組性別、年齡差異無統計學意義(P>0.05)。

表1　兩組一般資料比較

1.2實驗方法入試者均于清晨采集空腹靜脈血約5 ml，采用酚氯仿抽提的方法提取外周血白細胞的總DNA，并測定DNA的純度，并對含有SNP位點(rs57095329)的片段進行擴增，引物如下：上游為5′-CGGGGCTGCGGAGAGTCTAG-3′，下游為5′-GGACCCTCTTGCACACGTGTC-3′；擴增條件如下：95℃ 10 min后以60℃、15 s進行變性、60℃、60 s進行退火、72℃ 5 min后30 s進行延伸，此為1個循環，共40個循環。反應完畢后，取5 μl擴增產物分別利用限制性內切酶XbaI和PciI(美國NEB公司)進行酶切，瓊脂糖凝膠電泳后紫外線凝膠成像分析系統拍照并進行基因分型，同時將擴增產物送上海生物技術中心進行基因測序。

1.3統計學方法采用SPSS19.0統計軟件進行t、χ2檢驗。樣本代表性采用Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗。

2　結　果

2.1rs57095329基因型凝膠電泳圖rs57095329位點包括GG、AG和AA型3種基因型，見圖1。

2.2遺傳平衡檢驗兩組基因型分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，兩組具有群體代表性，見表2。

M為DNA Marker；1和2為GG型；3和4為AA型；5和6為AG型圖1　rs57095329基因型凝膠電泳

2.3兩組rs57095329基因型和等位基因比較病例組和對照組rs57095329基因型和等位基因比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表3。

2.4rs57095329基因型與癲癇發作頻率的關系rs57095329基因型與老年癲癇患者發作頻率無相關性(P>0.05)，見表4。

表4　rs57095329基因型與每月癲癇發作頻率〔n(%)〕

3　討　論

癲癇患病率較高，是神經科僅次于頭痛的第二大疾病〔6，7〕。癲癇的發病原因有很多，如遺傳因素、顱腦腫瘤、顱腦外傷、心血管疾病、代謝性疾病等，患者發作后的臨床癥狀也復雜多樣，常見的為發作性運動、感覺、自主神經、意識及精神障礙，嚴重影響患者的生活質量〔8，9〕。目前臨床上多采用藥物對癲癇患者進行治療和控制，多數患者在經過正規AEDs治療后可明顯控制癲癇發作，甚至痊愈，但也有部分患者經正規治療后仍無法控制，成為難治性癲癇〔10〕。目前對于癲癇的具體發病機制仍不完全清楚，多認為與離子通道神經遞質及神經膠質細胞的改變有關，而難治性癲癇的發生和機制可能與癲癇易感性和耐藥性有關〔11〕。miR是一類重要的內源性單鏈非編碼小RNA分子，可調控細胞生物的發育、增殖、分化、代謝、凋亡和應激等過程〔12〕。研究表明〔13〕，miR與癲癇的發生、發展等過程有密切關系，其中miR-146a作為免疫和炎癥反應的重要調控因子在這一過程中發揮著重要的作用。

SNP是一種分子標記，在人類基因組中常常密集分布，大約每1 000 bp有一個SNP位點，而SNP位點的多樣性在疾病關聯中分析中常常被廣泛應用。研究表明〔14〕，rs570953290是一個功能性的SNP，位于miR-146a基因的啟動子區域，其多態性與miR-146a基因的表達水平密切相關。本研究發現rs57095329位點包括GG、AG和AA型3種基因型，這與程衍楊等〔5〕的研究一致，本文提示s57095329位點多態性與癲癇易感性無相關性。本研究中，兩組G和A等位基因頻率并無明顯差異，但程衍楊等〔5〕的研究中發現癲癇組G等位基因頻率顯著高于對照組，其可能是難治性癲癇發生的風險因子；而Cui等〔15〕的研究顯示A等位基因與降低癲癇發作的次數相關，這與本研究的研究結果相差很大，其原因可能與入選標準和樣本不同有關。

本研究分析rs57095329基因型與老年癲癇患者易感性和發作頻率并無相關性的原因可能與以下因素有關：①癲癇的發病機制較為復雜，大多數均為多基因遺傳，可能涉及多個基因共同作用的結果，而少量樣本并不能覆蓋所有基因；②在與癲癇發作相關的基因中可能存在了多個作用位點，且可能只有其中一部分起到了關鍵作用；③不同種族和不同地域研究對象的結果可能會出現相關性不一致的結果。因此，對于miR-146a基因的rs57095329位點多態性與老年癲癇易感性和發作頻率的相關性仍需深入研究。

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4李瑞杰，顧家鵬，張學民，等.5種抗癲癇藥單藥治療新診斷癲癇患者2年保留率比較〔J〕.中國全科醫學，2015;18(9)：1037-41.

5程衍楊，何惠，劉奧杰，等.miRNA-146a基因多態性與兒童癲癇的相關性研究〔J〕.廣東醫學，2016;37(18)：2787-9.

6Fisher RS，Acevedo C，Arzimanoglou A，etal.ILAE official report：a practical clinical definition of epilepsy〔J〕.Epilepsia，2014;55(4)：475-82.

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10徐緩，徐曲榮.抗癲癇藥物對熱性驚厥相關癲癇患者發作控制的效果觀察〔J〕.臨床與病理雜志，2016;36(4)：413-6.

11張虎，杜欣娜，徐敏，等.GABAA受體基因多態性與癲癇易感性的關系〔J〕.中國老年學雜志，2015;35(19)：5439-41.

12徐冬云.胃癌發生相關的miRNA的篩選及miR-196a的功能學研究〔D〕.上海：第二軍醫大學，2015.

13張楠楠，朱喜科.癲癇與微小RNA和生酮飲食的研究進展〔J〕.中國神經免疫學和神經病學雜志，2014;21(6)：430-3.

14蔡文臣，郝小惠，沈陽麗，等.SNP位點rs6983267相關非編碼RNAG/U對結腸癌細胞轉移活性的影響〔J〕.山東醫藥，2016;56(45)：665-7.

15Cui L，Tao H，Wang Y，etal.A functional polymorphism of the microRNA-146a gene is associated with susceptibility to drug-resistant epilepsy and seizures frequency〔J〕.Seizure，2015;27(60)：60-5.