人乳頭瘤病毒E6蛋白通過上調氯離子蛋白通道5的表達促進宮頸癌細胞遷移

趙凱旋，徐靜云，盧春

（南京醫科大學病原微生物學系，江蘇南京211166）

高危型人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）持續感染是宮頸癌致病的關鍵因素，約99.7%的宮頸鱗狀細胞癌由HPV感染引起［1－2］。高危型HPV感染宮頸上皮細胞后可編碼兩種重要的致瘤蛋白——E6和 E7蛋白，以維持細胞的轉化特性［3－6］。研究顯示，E6通過結合并泛素化降解腫瘤抑制基因p53，阻斷細胞凋亡，E7則通過競爭性結合視網膜母細胞瘤蛋白pRb，促進轉錄因子E2F的釋放，從而調控細胞周期［7－8］，最終導致腫瘤的發生。隨著 HPV E6蛋白在誘導宮頸癌發生的分子機制方面的研究不斷深入，近年來的研究發現，HPV E6還可通過激活端粒酶活性、結合并降解含有PDZ結構域的蛋白等途徑促進宮頸癌的發生發展［9］。深入研究HPV E6蛋白促進宮頸癌發生發展的分子機制將有助于發現診斷和治療宮頸癌的有效靶標。

氯離子蛋白通道5（chloride voltage-gated channel 5，CLCN5）基因編碼的蛋白主要定位于內體膜，可促進腎近端小管對白蛋白的攝取［10－12］。已有文獻證明CLCN5基因的突變可導致Dent病［13］。然而，CLCN5基因在腫瘤尤其是在宮頸癌中的作用卻未見報道。

本研究在 HPV18陽性的HeLa細胞中敲低HPV E6后檢測CLCN5基因的表達。構建含CLCN5基因的重組質粒，并將重組質粒以及CLCN5的小干擾RNA（siCLCN5）分別轉染宮頸癌HeLa細胞，觀察CLCN5在宮頸癌細胞遷移過程中的作用。

1　材料與方法

1.1　細胞與試劑

人宮頸癌HeLa細胞和人胚腎293T細胞（中國科學院細胞庫）；pCDNA3.1-3×Flag（簡稱 pCDNA3.1）表達載體為本實驗室保存；E6小干擾RNA（siE6）和siCLCN5由上海吉瑪公司合成；實時熒光定量PCR（RT-qPCR）酶以及PCR所用的2×Phata HSMaster Mix購自南京諾維贊科技有限公司；PCR引物由南京鉑尚生物技術有限公司合成；限制性內切酶Bam HⅠ和NotⅠ（日本TaKaRa公司）；T4連接酶（美國Thermo Scientific公司）；胎牛血清（Gibco公司）；LipofectamineTM2000（Invitrogen公司）；抗CLCN5單克隆抗體（南京巴傲得生物科技有限公司）；抗α微管蛋白單克隆抗體（美國Santa Cruz公司）；抗HPV18 E6抗體（Abcam公司）；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG購自碧云天生物技術公司；Transwell小室（Millipore公司）。

1.2　E6和 CLCN5 siRNAs的轉染

將E6 siRNA和CLCN5 siRNA凍干粉瞬時離心至管底，加入無RNA酶水配制成終濃度為20μmol／L的樣品。選取生長良好的HeLa細胞接種于6孔板。次日，當細胞生長至70%匯合度時，用脂質體轉染試劑LipofectamineTM2000分別將siRNAs及其陰性對照（NC）轉染至HeLa細胞中，6 h后將細胞培養基更換為含10%胎牛血清的完全培養基。48 h后提取細胞總RNA和總蛋白，分別用于后續實驗檢測mRNA和目的蛋白的表達。

1.3　RT-qPCR檢測E6和CLCN5 mRNA轉錄水平

用Trizol試劑分別提取轉染陰性對照和E6 siRNA兩組細胞總RNA，按照反轉錄試劑盒說明書將RNA反轉錄為cDNA。以反轉錄后的cDNA為模板，RT-qPCR檢測E6和CLCN5mRNA的表達水平。反應體系：SYBR混合物10μL，上下游引物各0.4 μL，蒸餾水8.2μL。反應條件：95℃預變性30 s，95℃10 s、60℃30 s，共進行40個循環，最后以95℃15 s，60℃60 s，95℃15 s采集熔解曲線。

1.4　蛋白質印跡法檢測HeLa細胞中E6和CLCN5蛋白的表達

收集轉染陰性對照和E6 siRNA的細胞，提取總蛋白，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉膜，經5%脫脂牛奶封閉后將PVDF膜浸在E6和CLCN5一抗（用一抗稀釋液以1∶1 000的比例稀釋）中，4℃孵育過夜。TBST洗膜后，用相應的二抗37℃孵育1 h，進行蛋白顯色。

1.5　PCR擴增CLCN5基因

根據CLCN5基因的核酸序列設計PCR上下游引物。上游引物（下劃線為 Bam HⅠ識別序列），下游引物A-3′（下劃線為NotⅠ識別序列）。以293T細胞基因組DNA為模板，PCR擴增CLCN5序列。通過1%瓊脂糖核酸電泳鑒定PCR產物并進行切膠回收。

1.6　過表達質粒pCDNA3.1-CLCN5的構建與鑒定

用限制性內切酶Bam HⅠ和NotⅠ分別雙酶切載體pCDNA3.1和切膠回收的PCR產物，雙酶切產物純化后經T4DNA連接酶連接，連接產物轉化入感受態大腸埃希菌DH5α中，涂板并挑取有氨芐西林抗性的菌落進行擴增，通過質粒小提試劑盒提取重組質粒，進行雙酶切鑒定及核酸序列測定。

1.7　CLCN5在宮頸癌HeLa細胞中的表達

用脂質體轉染試劑LipofectamineTM2000分別將空載體 pCDNA3.1和上述構建好的過表達質粒pCDNA3.1-CLCN5轉染到宮頸癌HeLa細胞中，48 h后提取兩組細胞的總蛋白，蛋白質印跡法驗證標簽蛋白和CLCN5蛋白的表達。

1.8　Transwell遷移實驗

將Transwell小室置于24孔板中，向下室加入500μL含10%胎牛血清的DMEM培養基。將1×104個細胞重懸于200μL純DMEM培養基中，并接種至Transwell上室中，置于37℃、5%CO2培養箱培養12 h后，甲醇固定15 min，結晶紫染色15 min，流水漂洗晾干后置于顯微鏡下拍照并計數細胞。

1.9　統計學分析

實驗數據采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析，兩組均數間的比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1　敲低HPV E6對宮頸癌細胞中CLCN5表達水平的影響

RT-qPCR和蛋白質印跡檢測結果顯示，E6的mRNA和蛋白水平被明顯敲低，且與對照組相比，敲低E6后CLCN5的mRNA和蛋白水平也顯著下降（圖1）。

圖1　敲低HPV E6對宮頸癌細胞CLCN5表達的影響

2.2　過表達質粒pCDN3.1-CLCN5的構建與鑒定

以293T細胞基因組DNA為模板，PCR擴增CLCN5基因，利用1%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產物進行鑒定，大小約2 490 bp（圖2左），與預期條帶大小一致。采用限制性內切酶Bam HⅠ和NotⅠ雙酶切重組質粒pCDNA3.1-CLCN5，結果顯示出兩條特異性片段，大片段為載體pCDNA3.1，大小為5 508 bp，小片段為基因 CLCN5，大小為2 490 bp（圖2右）。核酸序列測定及比對結果顯示，插入的CLCN5基因序列正確，提示重組質粒 pCDNA3.1-CLCN5構建成功。

圖2　重組質粒pCDNA3.1-CLCN5的構建與鑒定

2.3　過表達CLCN5對HeLa細胞遷移的影響

蛋白質印跡結果顯示，CLCN5在HeLa細胞中過表達成功（圖3A）。Transwell遷移實驗結果表明，過表達CLCN5組的宮頸癌細胞的遷移數量明顯多于對照組（P＜0.01，圖3B），提示過表達 CLCN5可以促進宮頸癌細胞遷移。

2.4　敲低CLCN5基因對HeLa細胞遷移的影響

蛋白質印跡結果顯示，轉染siCLCN5后，HeLa細胞中CLCN5蛋白的表達水平得到有效抑制。Transwell遷移實驗結果顯示，與對照組比較，敲低CLCN5后HeLa細胞遷移數量明顯減少，表明敲低CLCN5可顯著抑制宮頸癌細胞的遷移。見圖4。

圖4　敲低CLCN5對宮頸癌HeLa細胞遷移的影響

3　討論

宮頸癌是導致女性癌癥死亡的第3主要原因［14］。其致病因素多種多樣，包括初次性生活的年齡、多個性伴侶、多次分娩、吸煙以及HPV的感染等。其中，高危型HPV的持續感染與宮頸癌的發生密切相關。HPV基因組包含早期基因區、晚期基因區以及長控制區，由早期基因區編碼的E6、E7早期蛋白在病毒的生命周期及細胞轉化中發揮了重要作用。

研究發現，HPV E6蛋白通過E6AP泛素途徑降解p53是導致宮頸癌發生的重要分子機制［15－16］。HPV E6可通過調節鈣黏蛋白轉換促進宮頸癌細胞的遷移和侵襲［17］。且 E6可通過上調 miRNA-20b的表達，靶向抑制TIMP-2，從而增加宮頸癌細胞的侵襲力。E6還可活化鈣調磷酸酶-NFAT信號促進宮頸癌細胞的增殖［18］。HPV E6靶向 TRIM25和USP15后可拮抗細胞質先天性免疫傳感器RIG-1的活化［19］。同時，E6還可通過分泌促炎細胞因子和趨化因子修飾細胞微環境，從而影響免疫應答的功效［20］。充分了解和研究HPV E6蛋白的致病機制，對尋找預防和治療宮頸癌的潛在靶標有重要意義。

既往研究結果表明，CLCN5基因突變可導致Dent病的發生，然而CLCN5基因在宮頸癌中的作用并未被闡明，且TCGA數據庫的結果顯示，CLCN5在宮頸癌中高表達。因此，我們猜測CLCN5可能參與調控了宮頸癌的發生、發展。本實驗選取了HPV18陽性的HeLa細胞，采用RNA干擾技術敲低E6表達，結果顯示，CLCN5 mRNA和蛋白水平均顯著下調，提示HPV E6蛋白可能通過上調CLCN5的表達促進宮頸癌的發生、發展，過表達和敲低CLCN5后的功能學實驗結果也初步證實CLCN5具有促進宮頸癌HeLa細胞遷移能力的作用。目前對于HPV E6蛋白調控CLCN5基因的分子機制有待于進一步研究，HPV E6蛋白可能通過結合并激活CLCN5啟動子促進CLCN5的表達；HPV E6蛋白還可能通過促進 p53降解上調 CLCN5基因；此外，HPV E6蛋白可能通過抑制某些miRNAs的表達，使得CLCN5表達量增加，從而促進宮頸癌的遷移。

綜上所述，本研究證實了 HPV E6蛋白對CLCN5基因的正調控作用，并且初步表明了CLCN5在宮頸癌細胞中具有促進細胞遷移的作用，為探索HPV E6蛋白調控CLCN5在腫瘤中的作用提供了線索，且CLCN5有望成為預防和治療宮頸癌的新靶點。

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