胃癌組織DNA拓撲異構酶2α等8種分子的蛋白表達與脈管侵犯的關系

戴東方，陳德玉，李小琴，顧漢剛，王德強

（江蘇大學附屬醫院腫瘤科，江蘇鎮江212001）

我國每年新發胃癌病例近70萬，位居世界首位［1－2］。根治性手術仍然是胃癌最主要的治愈性手段，但患者術后仍然普遍面臨復發轉移風險。美國國立綜合癌癥網絡（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）的胃癌臨床實踐指南將低分化、脈管侵犯、神經侵犯、年齡＜50歲及非D2根治術均列為術后復發轉移的高危因素［3］。其中，脈管侵犯與胃癌臨床病理特征及預后的密切關系已有報道［4－6］，但伴脈管侵犯胃癌的分子特征尚不清楚。因此，本研究回顧性比較了有和無脈管侵犯胃癌患者之間常見的8種免疫組化分子標志物表達的差異。

1　對象與方法

1.1　病例

收集2012年1月1日至2014年1月1日在江蘇大學附屬醫院手術治療的胃癌患者242例，其中男179例，女63例；年齡35～75歲，中位年齡60歲。納入標準：①年齡18～75歲；② 病理學確診為胃腺癌；③術前未行放化療及生物靶向治療。

1.2　主要試劑

微管蛋白 β3、胸苷酸合酶（thymidylate synthase，TS）、非轉移蛋白 23（nonmetastatic protein 23，NM23）、P糖蛋白、增殖標記Ki-67、DNA拓撲異構酶2α（topoisomerase 2-alpha，TOP2A）、切除修復交叉互補酶1（excision repair cross-complementation group 1，ERCC1）及人類表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）的抗體，免疫組織化學染色試劑盒及二氨基聯苯胺顯色試劑盒等均購自珠海泉暉公司。

1.3　HE染色判斷脈管侵犯

石蠟包埋的組織樣本切片厚度為5μm，行HE染色。脈管侵犯的定義為腫瘤細胞對血管或淋巴管管壁的侵犯或者在內皮細胞襯里的空間中發現瘤栓［7］。血管或淋巴管管腔的識別［5］：① 內皮細胞襯里；②有平滑肌或彈性組織支撐；③有淋巴液或紅細胞填充。

1.4　免疫組織化學染色檢測

免疫組織化學染色采用SP法，操作步驟嚴格按試劑盒的說明書進行，空白對照為PBS液，陽性對照為各受檢分子的陽性切片。結果判讀標準：HER2的結果判讀標準依據美國病理學會和臨床腫瘤學會的專項指南［8］。其他分子標志物的結果判讀采用半定量法，即染色陽性細胞數比例與染色強度等級之積［9］，具體為① 計算每張切片中陽性細胞的百分比：選擇10個高倍視野（×400），每個視野計數100個細胞中的陽性細胞數，陽性細胞少于10%為0級，10%～25%為1級，26%～50%為2級，51%～75%以上為3級，76%～100%為4級；②判讀染色強度：無著色為0級，淺棕色為1級，棕色為2級，深棕色為3級；③ 根據二者之乘積，≥6為高表達，＜6為低表達。

1.5　統計學分析

應用SPSS 17.0統計軟件進行分析。計數資料采用雙側χ2檢驗。雙側P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1　有和無脈管侵犯胃癌患者臨床病理特征的比較

242例患者中有脈管侵犯81例（33.5%）。在有脈管侵犯胃癌患者中，女性、腫瘤最大徑≥5cm、伴神經侵犯及TNM分期Ⅲ－Ⅳ期的比例均顯著高于無脈管侵犯胃癌患者（P＜0.05或 P＜0.001）。見表1。

2.2　有和無脈管侵犯胃癌患者8種分子的蛋白表達

如圖1所示，棕褐（黑）色顆粒為染色陽性，染色陽性的 Ki-67、TOP2A及ERCC1主要見于細胞核，而微管蛋白 β3、TS、NM23、P糖蛋白及 HER2在胞核胞質均可見陽性染色。有脈管侵犯胃癌患者的TOP2A高表達率為89.3%，顯著高于無脈管侵犯者的72.9%（P＜0.05），而微管蛋白 β3、TS、NM23、P糖蛋白、Ki-67、ERCC1及HER2的高表達率在兩組間無顯著差異（P＞0.05）。見表2。

表1　有和無脈管侵犯胃癌患者臨床病理特征的比較

圖1　各分子標志物的陽性染色（免疫組織化學染色×200）

表2　有和無脈管侵犯胃癌患者8種分子的表達差異

續表

2.3　有和無脈管侵犯胃癌患者TOP2A表達的亞組比較

有和無脈管侵犯胃癌患者之間TOP2A高表達率的差異主要出現于女性（100%vs 72.2%，P＝0.045）和組織學分級Ⅲ級的亞組中（89.3%vs 67.6%，P＝0.040）。在其他臨床病理特征的亞組中均未發現TOP2A高表達率在兩組間存在顯著差異。見表3。

3　討論

脈管侵犯是腫瘤細胞對血管或淋巴管的侵犯，在各種腫瘤中均較為常見。在胃癌中，伴脈管侵犯者的比例報道不一。在一項中國南方人群的研究中，采用HE染色法從1 148例胃癌患者中發現伴脈管侵犯者比例為 35.2%（404例）［5］。此前，del Casar等［10］采用HE染色與CD34免疫組化檢測相結合的方法在胃癌中辨別脈管侵犯，報道的比例為31.9%。以上均與本組人群33.5%的脈管侵犯比例相近。但是，Kim等［11］完全采用D2－40及CD34免疫組化法在胃癌中檢測得到的結果為44.3%，表明不同方法對結果有影響。HE染色法是目前應用最廣泛且簡單易行的判定脈管侵犯的方法，并且該方法所得結果與腫瘤患者臨床結局之間具有顯著相關性，表明了該方法的可靠性［12－14］。

脈管侵犯是腫瘤局部擴散的重要途徑。研究顯示，脈管侵犯與腫瘤侵襲能力及淋巴結轉移顯著相關，同時提示脈管侵犯與腫瘤預后的相關性［12－15］。在胃癌中，早期的數項小樣本研究均發現脈管侵犯者的生存期較無脈管侵犯者短［10－11，16］。而 Li等［5］包括了1 148例胃癌患者的研究進一步發現脈管侵犯是預后的獨立預測因子。最近，Zhao等［4］在1 019例中國西部胃癌患者中的結果也證實了脈管侵犯獨立的預后預測作用，且與淋巴結計數和腫瘤大小聯合可以進一步提高預后預測的準確性。

表3　有和無脈管侵犯胃癌患者TOP2A表達的亞組比較

脈管侵犯與胃癌臨床病理特征關系的報道較為一致，例如與腫瘤大小、分化、神經侵犯及分期等顯著相關［4－6，10－11，16］，本研究的結果亦與之相符。本研究結果表明，有脈管侵犯者的TOP2A高表達率顯著高于無脈管侵犯者，且這種差異在女性及組織學分級Ⅲ級的患者中尤為明顯，提示伴脈管侵犯者尤其是某些亞組有獨特的分子特征。

TOP2A基因編碼DNA拓撲異構酶2α，通過對DNA拓撲結構的控制，在DNA轉錄和復制過程中起著關鍵作用［17］。最近，一項轉錄組測序研究和一項基因芯片研究均提示TOP2A是胃癌發生過程中的關鍵性基因［18－19］。更為重要的是，Terashima等［20］發現TOP2A基因mRNA表達水平與胃癌復發有關，是胃癌復發的獨立風險因素。因此，本研究關于脈管侵犯者TOP2A高表達率較高的結果，可能提示了脈管侵犯及其預后差的一種分子機制。

TOP2A是蒽環類化療藥的直接靶標。最近的一項納入了2 012例早期乳腺癌患者的3期臨床試驗發現，TOP2A與蒽環類藥物輔助化療的療效有關［21］。蒽環類也是胃癌的有效治療藥物，3期臨床試驗證實了含表柔比星化療方案在胃癌術后輔助化療 中 的 療 效［22－24］。此 外，Terashima等［20］發 現TOP2A高表達胃癌患者在替吉奧輔助化療后的無復發生存時間顯著劣于低表達者，提示TOP2A與氟尿嘧啶類藥物療效有關。因此，本研究關于脈管侵犯者TOP2A高表達率較高的結果，可能也提示此類患者對上述藥物的抗性，值得進一步研究。

綜上所述，伴脈管侵犯胃癌患者的TOP2A蛋白表達升高，特別是在女性和組織學分級Ⅲ級患者中更為明顯。結合 TOP2A現有的臨床意義，提示TOP2A在伴脈管侵犯胃癌患者中的臨床相關性，可以作為未來的研究方向之一。

［參考文獻］

［1］Chen W，Zheng R，Baade PD，et al.Cancer statistics in China，2015［J］.CA Cancer JClin，2016，66（2）：115－132.

［2］Torre LA，Bray F，Siegel RL，et al.Global cancer statistics，2012［J］.CA Cancer JClin，2015，65（2）：87－108.

［3］Ajani JA，D′Amico TA，Almhanna K，et al.Gastric Cancer，Version 3.2016， NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology［J］.JNatl Compr Canc Netw，2016，14（10）：1286－1312.

［4］Zhao LY，Chen XL，Wang YG，et al.A new predictive model combined of tumor size，lymph nodes count and lymphovascular invasion for survival prognosis in patients with lymph node-negative gastric cancer［J］.Oncotarget，2016，7（44）：72300－72310.

［5］Li P，He HQ，Zhu CM，et al.The prognostic significance of lymphovascular invasion in patientswith resectable gastric cancer：a large retrospective study from Southern China［J］.BMC Cancer，2015，15：370.

［6］Lee JH，Kim MG，Jung MS，et al.Prognostic significance of lymphovascular invasion in node-negative gastric cancer［J］.World JSurg，2015，39（3）：732－739.

［7］Mete O，Asa SL.Pathological definition and clinical significance of vascular invasion in thyroid carcinomas of follicular epithelial derivation［J］.Mod Pathol，2011，24（12）：1545－1552.

［8］Bartley AN，Washington MK，Colasacco C，et al.HER2 testing and clinical decision making in gastroesophageal adenocarcinoma：Guideline from the College of American Pathologists，American Society for Clinical Pathology，and the American Society of Clinical Oncology［J］.JClin Oncol，2017，35（4）：446－464.

［9］Li JC，Yang XR，Sun HX，et al.Up-regulation of Kr ppel-like factor 8 promotes tumor invasion and indicates poor prognosis for hepatocellular carcinoma［J］.Gastroenterology，2010，139（6）：2146－2157.

［10］del Casar JM，Corte MD，Alvarez A，et al.Lymphatic and／or blood vessel invasion in gastric cancer：relationship with clinicopathological parameters，biological factors and prognostic significance［J］.JCancer Res Clin Oncol，2008，134（2）：153－161.

［11］Kim JH，Park SS，Park SH，et al.Clinical significance of immunohistochemically-identified lymphatic and／or blood vessel tumor invasion in gastric cancer［J］.JSurg Res，2010，162（2）：177－183.

［12］Zhang S，Zhang D，Gong M，etal.High lymphatic vessel density and presence of lymphovascular invasion both predict poor prognosis in breast cancer［J］.BMC Cancer，2017，17（1）：335.

［13］Yuan H，Dong Q，Zheng B，et al.Lymphovascular invasion is a high risk factor for stageⅠ／Ⅱ colorectal cancer：a systematic review and meta-analysis［J］.Oncotarget，2017，8（28）：46565－46579.

［14］Kinoshita T，Ohtsuka T，Yotsukura M，etal.Prognostic impact of preoperative tumormarker levels and lymphovascular invasion in pathological stageⅠadenocarcinoma and squamous cell carcinoma of the lung［J］.JThorac Oncol，2015，10（4）：619－628.

［15］Gresta LT，Rodrigues-Junior IA，de Castro LP，et al.Assessment of vascular invasion in gastric cancer：a comparative study［J］.World JGastroenterol，2013，19（24）：3761－3769.

［16］Du CY，Chen JG，Zhou Y，et al.Impact of lymphatic and／or blood vessel invasion in stageⅡ gastric cancer［J］.World J Gastroenterol，2012，18（27）：3610－3616.

［17］Baxter J，Sen N，Martínez VL，etal.Positive supercoiling ofmitotic DNA drives decatenation by topoisomeraseⅡin eukaryotes［J］.Science，2011，331（6022）：1328－1332.

［18］Li X，DongW，Qu X，etal.Molecular dysexpression in gastric cancer revealed by integrated analysis of transcriptome data［J］.Oncol Lett，2017，13（5）：3177－3185.

［19］Wang Y.Transcriptional regulatory network analysis for gastric cancer based on mRNA microarray［J］.Pathol Oncol Res，2017，23（4）：785－791.

［20］Terashima M，Ichikawa W，Ochiai A，et al.TOP2A，GGH，and PECAM1 are associated with hematogenous，lymph node，and peritoneal recurrence in stageⅡ／Ⅲgastric cancer patients enrolled in the ACTS-GC study［J］.Oncotarget，2017，8（34）：57574－57582.

［21］Ejlertsen B，Tuxen MK，Jakobsen EH，et al.Adjuvant cyclophosphamide and docetaxelwith or without epirubicin for early TOP2A-normal breast cancer：DBCG 07-READ，an open-label，phaseⅢ，randomized trial［J］.JClin Oncol，2017，35（23）：2639－2646.

［22］Cunningham D，Allum WH，Stenning SP，etal.Perioperative chemotherapy versus surgery alone for resectable gastroesophageal cancer［J］.N Engl JMed，2006，355（1）：11－20.

［23］Sumpter K，Harper-Wynne C，Cunningham D，et al.Report of two protocol planned interim analyses in a randomised multicentre phaseⅢstudy comparing capecitabine with fluorouracil and oxaliplatin with cisplatin in patients with advanced oesophagogastric cancer receiving ECF［J］.Br JCancer，2005，92（11）：1976－1983.

［24］Cunningham D，Starling N，Rao S，et al.Capecitabine and oxaliplatin for advanced esophagogastric cancer［J］.N Engl JMed，2008，358（1）：36－46.