rL-IL29對肺腺癌A549細胞生物學特性的影響及相關機制

杭敏，嚴玉蘭，邵小美，張日婷，步雪峰

（1.江蘇大學醫學院，江蘇鎮江212013；2.江蘇大學附屬人民醫院呼吸內科，江蘇鎮江212002；3.江蘇大學附屬人民醫院普外科，江蘇 鎮江212002）

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，發病率及死亡率在多數國家均呈上升趨勢［1］。盡管目前包括手術、放化療及靶向治療在內的主要治療手段在不斷進步，但多數患者治療過程中病情仍迅速進展和出現復發轉移。局部浸潤和轉移是癌癥致死的主要原因，腫瘤細胞的遷移和侵襲也是促進腫瘤轉移的關鍵環節。本實驗組前期研究已發現，表達IL-29的重組新城疫病毒 LoSota株（recombinant Newcastle disease virus LoSota line expressing IL-29，rL-IL29）能抑制肺腺癌A549細胞的增殖及遷移，但未進一步觀察其對肺癌細胞株侵襲力的影響及其可能的作用機制［2］。故本實驗將rL-IL29感染肺腺癌A549細胞，采用CCK法、劃痕試驗及Transwell侵襲實驗觀察A549細胞的增殖、遷移和侵襲，并運用蛋白質印跡法檢測細胞 E-鈣黏蛋白、MMP2、波形蛋白及AKT／NF-κB相關蛋白的表達水平，進一步探索rLIL29對肺腺癌A549細胞增殖、遷移和侵襲的影響及其可能機制。

1　材料與方法

1.1　細胞株與主要試劑

人肺腺癌A549細胞株由江蘇大學基礎醫學研究所保存，LoSota株新城疫病毒（Newcastle disease virus LoSota，NDVL）、雞抗NDV HN蛋白抗體由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所惠贈；rL-IL29由本課題組成員在中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所構建。DMEM及胎牛血清（維森特生物技術南京公司）；CCK8試劑盒（南京厚載生物科技有限公司）；Transwell小室（美國康寧公司）；鼠抗β-肌動蛋白抗體（美國Santa Cruz公司）；兔抗IL-29、E-鈣黏蛋白、MMP2（72、66 kDa）、波形蛋白、p-AKT、P65抗體（美國博士德生物公司）；HRP標記的山羊抗鼠二抗、HRP標記的山羊抗兔二抗（康為世紀公司）；HRP標記的兔抗雞二抗（美國Earthox公司）。

1.2　A549細胞的培養及病毒感染分組

NDVL及rL-IL29病毒原液的滴度分別為雞胚半數感染量（50%egg infective doses，EID50）109.1、108.5 EID50／mL左右。用無血清的DMEM分別稀釋NDVL及rL-IL29原液（1∶1 000）。接種對數生長期A549細胞在含10%胎牛血清的DMEM培養基中，置于37℃、5%CO2的培養箱培育2～3 d換液，待細胞密度達70%～80%時，隨機分為PBS組、NDVL組及rL-IL29組，分別加入PBS及稀釋后的NDVL及rL-IL29病毒液，繼續培養24 h。

1.3　蛋白質印跡法檢測A549細胞中NDV HN、IL-29、E-鈣黏蛋白、MMP2、波形蛋白及 PI3K／AKT／NF-κB通路相關蛋白的表達

分別收集上述3組細胞并提取蛋白，BCA試劑盒定量各組蛋白。配置SDS-PAGE凝膠（10%的分離膠和5%的濃縮膠），蛋白上樣，先80 V 20min，再120 V 70 min電泳，結束后350 mA恒流轉膜1.5 h（電壓60～70 V），脫脂奶粉室溫封閉1 h；加入雞抗NDV HN蛋白抗體（1∶800）或兔抗 IL-29、E-鈣黏蛋白、MMP2、波形蛋白、p-AKT、P65抗體（1∶300）以及鼠抗β-肌動蛋白抗體（1∶2 000），4℃孵育過夜；TBST洗膜30 min／次，共3遍，后分別加入相應的二抗37℃保溫箱孵育1 h；TBST洗膜30 min／次，共3遍，曝光獲得目的條帶。采用β-肌動蛋白作為內參，測定各泳道目的蛋白的灰度值并計算比值。

1.4　CCK8法檢測rL-IL29感染對A549細胞增殖的影響

用無血清DMEM稀釋病毒原液至以下濃度：1×10－2、1×10－3、1×10－4、1×10－5。將對數生長期A549細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養基制成約1×105個／mL密度的細胞懸液，取100μL置96孔板（邊緣孔用無菌水填充），置37℃、5%CO2培養箱孵育過夜。每孔加入不同濃度的NDVL及rLIL29感染細胞，以加入PBS作為對照組，每組設3個復孔，置37℃、5%CO2培養箱孵育24 h。每孔加入10μL CCK8溶液，37℃孵育1 h。同時設置空白孔（僅加培養基及CCK8溶液，無細胞）。用酶標儀測定450 nm各孔的D值。細胞活力（%）＝（實驗組D值－空白D值）／（對照組D組－空白D值）×100%。

1.5　劃痕實驗檢測rL-IL29感染對A549細胞遷移的影響

接種對數生長期A549細胞于24孔板中，用含10%胎牛血清的DMEM培養基培育，待細胞匯合度達80%～90%時，用無菌200μL加樣槍頭在細胞層中縱向劃一條直線，保持寬度均勻一致；PBS洗3遍后，分別加入DMEM培養基稀釋后的PBS（對照組）、NDVL及 rL-IL29（1∶1 000）；每組均設立2個復孔。分別于劃痕后0、48 h在倒置相差顯微鏡下觀察劃痕間距。

1.6　Transwell法檢測rL-IL29感染對A549細胞侵襲的影響

將對數生長期A549細胞，用無血清DMEM配制成約1×105個／mL密度的細胞懸液，取200μL滴入24孔板Transwell小室的上室，下室分別加入含10%胎牛血清的DMEM培養基稀釋的PBS（對照組）、NDV及 rL-IL29（1∶1 000）各500μL，每組均設立2個復孔，37℃、5%CO2的培養箱內培育24 h。用棉簽擦去Transwell上室聚碳酸酯膜表面的細胞，PBS洗2遍，將上室置于4%多聚甲醛中固定15 min。PBS洗2遍后，結晶紫染色20 min，再用PBS洗2遍后，倒置相差顯微鏡下計數10個不同視野的細胞數，計算平均值。

1.7　統計學處理

2　結果

2.1　感染rL-IL29后的A549細胞表達NDV HN和IL-29蛋白

蛋白質印跡檢測結果顯示，rL-IL29及NDVL感染A549細胞24 h后，NDV-HN蛋白在NDVL組及rLIL29組均穩定表達，且rL-IL29組表達量高于NDVL組，而PBS組未見NDV-HN表達；rL-IL29組IL-29蛋白的表達水平明顯高于NDVL組和PBS組。見圖1。

圖1　A549細胞感染rL-IL29后NDV HN和IL-29蛋白的表達

2.2　rL-IL29感染后A549細胞增殖能力下降

CCK8細胞增殖實驗結果顯示，rL-IL29及NDVL感染A549細胞24 h后能夠抑制細胞的增殖，且rL-IL29組的細胞活力明顯低于 NDVL組（P＜0.05）；隨著病毒稀釋倍數的增加，NDV組及 rLIL29組A549細胞活力逐步增強。見圖2。

圖2　不同濃度的rL-IL29及NDVL對A549細胞生長的影響

2.3　A549細胞感染rL-IL29后遷移能力降低

劃痕后48 h顯微鏡下觀察各組細胞由兩側向中央遷移的距離，結果顯示rL-IL29組A549細胞遷移率明顯低于 NDVL組和 PBS組（t＝10.87，20.04；P＜0.05），NDV組A549細胞遷移率明顯低于PBS組（t＝25.92，P＜0.05）。見圖3。

圖3　rL-IL29及NDVL感染對A549細胞遷移能力的影響（劃痕實驗×40）

2.4　A549細胞感染rL-IL29后侵襲能力降低

Transwell檢測顯示，rL-IL29組A549細胞穿過Transwell小室的細胞數明顯少于NDVL組和PBS組（t＝10.29，14.97；P＜0.05），NDVL組 A549細胞穿過Transwell小室的細胞數亦明顯少于PBS組（t＝8.449，P＜0.05）。見圖4。

圖4　rL-IL29及NDVL感染對A549細胞侵襲力的影響（Transwell侵襲實驗×200）

2.5　rL-IL29感染對 A549細胞中 E-鈣黏蛋白、MMP2、波形蛋白及AKT／NF-κB相關蛋白表達的影響

蛋白質印跡結果顯示，與PBS組比較，NDVL組A549細胞中E-鈣黏蛋白表達量顯著增加（t＝12.65，P＜0.05），而波形蛋白、MMP2前體和激活體（66 kDa／72 kDa）、p-AKT及 P65蛋白表達均明顯降低（t＝2.97，2.86，6.871，3.286，3.534；均 P＜0.05）。與 NDVL組比較，rL-IL29組A549細胞E-鈣黏蛋白表達量明顯增加（t＝18.66，P＜0.05），其余蛋白表達均明顯下降（t＝6.04，6.018，11.25，5.095，9.058；均 P＜0.05）。見圖5。

圖5　感染rL-IL29及NDVL后A549細胞中E-鈣黏蛋白、MMP2、波形蛋白及AKT／NF-κB相關蛋白的表達

3　討論

NDV屬于溶瘤病毒，能高度選擇性殺傷腫瘤細胞且不損傷正常細胞。近年來大量研究表明溶瘤病毒治療腫瘤安全且有效［3－5］。IFNλ家族是2003年Sheppard等［6］首先報告的一組新型人白細胞介素（interleukin，IL），又名Ⅲ型 IFN，包括 IL-29（IFN-λ1）、IL-28A（IFN-λ2）和 IL-28B（IFN-λ3）。其結構與Ⅰ型IFN相似，功能較Ⅰ型IFN增強，具有抗病毒、抗增殖、抗腫瘤以及免疫調節等生物學活性。人體中IL-29活性最強。研究發現人體不同器官的IL-28R1表達水平具有明顯差異，IL-29在多種細胞中均有表達，而IL-29通過與IL-28R1結合發揮生物學效應，說明 IL-29的特異性靶細胞呈高度局限性［7］。因此，與Ⅰ型IFN相比，IL29療效高而毒副反應小。Numasaki等［8］通過質粒轉導 IFNλ促使鼠纖維肉瘤MCA205細胞分泌m IFN-λ，發現體內成瘤受到明顯抑制且皮下瘤肺轉移灶明顯減少。

上皮細胞間質化對腫瘤細胞的原位侵襲和遠處轉移過程起重要作用。上皮細胞間質轉化過程通常伴有上皮標志物如E-鈣黏蛋白等的下調和間質標志物如波形蛋白等的上調［9］。基質金屬蛋白酶如MMP2／9，能降解基底膜細胞外基質、促進腫瘤細胞侵襲周邊結締組織進入脈管系統形成轉移灶［10－11］。本研究蛋白質印跡結果顯示，rL-IL29感染后可上調E-鈣黏蛋白表達水平及下調MMP2、波形蛋白表達。推測rL-IL29可通過調控上皮細胞間質化相關因子活性抑制腫瘤細胞的侵襲及遷移。

PI3K／AKT信號通路與腫瘤的發生、發展密切相關，其活化可促進腫瘤細胞的增殖及轉移，抑制凋亡及阻斷腫瘤新生血管形成等［12］。活化的AKT（p-AKT）通過下游多種途徑對靶蛋白進行磷酸化而發揮作用［13］。本研究結果顯示，rL-IL29可下調A549細胞株中AKT的磷酸化水平。另已發現PI3K／AKT轉導路徑通過調節肺腺癌MMPs表達參與腫瘤轉移及浸潤［14］。因此rL-IL29對肺腺癌A549細胞株的侵襲、轉移能力的影響可能與PI3K／AKT信號通路相關。PI3K／AKT的下游蛋白NF-κB是機體內具有多種調控作用的轉錄因子，參與了腫瘤細胞的分化、凋亡和遷移，可促進腫瘤發展的進程［15］。P65為NF-κB家族的重要成員，一般以非活性的 P65／P50／IκB（κB抑制物）聚體復合物存在于胞質內［16］，受到炎癥因子刺激后磷酸化激活從而發揮促腫瘤作用。研究發現［17］，NF-κB可調節 MMPs的表達，從而促進腫瘤遷移、侵襲。本實驗結果表明，rL-IL29可下調P65蛋白表達水平。因此推測rL-IL29可通過AKT／NF-κB路徑調節肺腺癌A549細胞株的侵襲、轉移能力。

綜上，本研究表明rL-IL29可能通過阻礙AKT／NF-κB信號通路，上調 E-鈣黏蛋白的表達和下調MMP2、波形蛋白的表達，從而抑制肺腺癌A549細胞的侵襲及遷移，但具體的作用機制仍需進一步證實。

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