根癌農桿菌介導的玉米萌動胚ＮPR1基因遺傳轉化

摘要：以玉米萌動胚為外植體，研究了影響根癌農桿菌介導的玉米ＮＰＲ１基因遺傳轉化的若干因素。結果表明，在感染液和共培養基中分別都加入１００ μｍｏｌ／Ｌ乙酰丁香酮，根癌農桿菌ＬＢＡ４４０４的菌液，浸染時間１２ ｈ，４０ ｍｇ／Ｌ潮霉素進行轉化苗篩選，為轉化的適宜條件。對轉化苗進行ＰＣＲ檢測，證明外源目的基因已整合到玉米基因組中。

關鍵詞：玉米；根癌農桿菌介導；遺傳轉化；ＮＰＲ１基因；萌動胚

中圖分類號：Ｓ５１３；Ｑ７８文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）14－2985-03

Genetic Transformation of NPR1 Gene to Germinating Embryo of Maize by Agrobacterium tumefaciens

ＱＩＮ Ｘｉｎ－ｍｉｎ，ＺＥＮＧ Ｄｅ－ｌｏｎｇ，ＬＩ Ｈｕｉ－ｍｉｎ，ＱＩＮ Ｐｉｎｇ－ｓｈｅｎｇ

（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｇｕａｎｇｘｉ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕｉｌｉｎ ５４１００４，Ｇｕａｎｇｘｉ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｕｓｉｎｇ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ ｅｍｂｒｙｏ ｏｆ ｍａｉｚｅ ａｓ ｅｘｐｌａｎｔｓ， ｓｅｖｅｒａｌ ｆａｃｔｏｒｓ ａｆｆｅｃｔｉｎｇ ｔｈｅ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ that ｇｏｏｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｉｆ ｔｈｅ ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｏｆ ａｃｅｔｏｓｙｒｉｎｇｏｎｅ ｉｎ ｂｏｔｈ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ ａｎｄ ｃｏ－ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ ｗａｓ １００ μｍｏｌ／Ｌ； ＯＤ６００ｎｍ ｏｆ ＬＢＡ４４０４ ｆｅｒｍｅｎｔｉｎｇ ｌｉｑｕｏｒｗａｓ ０．６； ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｗａｓ １２ ｈ； ａｎｄ ｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅ ｆｏｒ １６ ｈ ａｔ ２６ ℃， ｕｓｅ ４０ ｍｇ／Ｌ ｏｆ ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ ｆｏｒ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｐｌａｎｔｓ． ＰＣＲ ｔｅｓｔ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ＮＰＲ１ ｇｅｎｅ ｈａｄ ｂｅｅｎ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ ｉｎｔｏ ｍａｉｚｅ ｇｅｎｏｍｅ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｍａｉｚｅ； Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄ； ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ； ＮＰＲ１ ｇｅｎｅ； ｇｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ ｅｍｂｒｙｏ

玉米是世界重要的糧食作物之一，栽培面積僅次于小麥和水稻居第三位，但產量卻居世界第一。在玉米栽培過程中病害嚴重，如大小斑病、青枯病、病毒病、銹病等嚴重影響玉米的產量和品質。因此，生產上亟需優良抗病的玉米品種。轉基因技術是培育抗病、高產、優質品種的有效途徑之一。

ＮＰＲ１基因是植物系統獲得性抗性中的一個關鍵基因，它可調控植物的廣譜性抗性的發生，在植物系統性抗病中起著關鍵的作用［１］。ＮＰＲ１基因的表達可導致下游抗病基因的一系列反應，從而賦予植株對細菌病原體和真菌病原體的抗性，即使ＮＰＲ１基因過量表達也只是提高了植物的抗病性，并無其他的不良反應［２］。ＮＰＲ１基因功能是通過將克隆的野生型ＮＰＲ１基因轉化到擬南芥ＮＰＲ１基因突變體中，恢復了突變體抵抗Ｐseudomonas ｓｙｒｉｎｇａｅ和Ｐhytophthora ｐａｒａｓｉｔｉｃａ的能力［３］來證實的。Ｃｈｅｒｎ等［４］在通過讓水稻過量表達擬南芥ＮＰＲ１基因的實驗來確定ＮＰＲ１基因在單子葉植物中所扮演的角色時，發現轉基因水稻植株表現出對Ｘｏｏ（一種水稻細菌性枯葉病原體）的抗性提高，首次證明了ＮＰＲ１基因可以提高單子葉植物的抗病性。因此，ＮＰＲ１基因作為植物廣譜抗病性基因日漸受到人們的關注。

利用構建的ＮＰＲ１基因表達載體，采用根癌農桿菌介導方法，以玉米成熟萌動胚為轉化受體，建立了根癌農桿菌介導玉米萌動胚的遺傳轉化體系，獲得了轉基因植株。經分子檢測證明外源ＮＰＲ１抗病基因已整合進轉基因玉米的基因組中。

１材料與方法

１．１材料

根癌農桿菌為ＬＢＡ４４０４，所用的植物表達載體為ｐＣａＭＶＮＰＲ（帶有ＮＰＲ１基因和選擇性標記潮霉素磷酸轉移酶基因［５］）。實驗材料為玉米自交系７２３９。

１．２方法

１．２．１種子處理參照王昌濤等人的方法［６］并稍加改進。玉米種子用自來水沖洗干凈，將種子浸泡在無菌水中，置于３７ ℃、４～５ ｈ，用體積分數為７０％的酒精浸泡種子１ ｍｉｎ，１ ｇ／Ｌ升汞消毒８ ｍｉｎ，無菌水沖洗４次，超凈臺上用解剖刀在玉米胚上縱向劃開１～３ ｍｍ深的口子，然后將種子浸泡在無菌水中。

１．２．２根癌農桿菌介導的轉化與抗性植株的篩選

１）感染液制備。平板上挑根癌農桿菌單菌落接種于５ ｍＬ ＹＥＢ培養液中（含５０ ｍｇ／Ｌ利福平，２５ ｍｇ／Ｌ潮霉素），２８ ℃、２００ ｒ／ｍｉｎ振蕩培養過夜。離心收集菌體，加入５０ ｍＬ新鮮ＹＥＢ液體培養基（含１００ μｍｏｌ／Ｌ乙酰丁香酮）繼續振蕩培養至對數生長期。

２）浸染轉化。將準備好的玉米萌動胚放入上述根癌農桿菌液中，２８ ℃、２００ ｒ／ｍｉｎ繼續振蕩１２～２４ ｈ，然后把種子放在ＭＳ固體培養基上，黑暗共培養３ ｄ。

３）抗性苗的篩選。將共培養后的玉米種子在超凈臺上用無菌水沖洗４次，將大部分根癌農桿菌除去，再轉入帶有潮霉素的篩選培養基中進行萌發篩選。

４）抗性苗的移栽。７～１０ ｄ后將根系發達、生長正常的綠苗取出，用自來水將根系上的培養基沖洗干凈，移栽到通氣、保水良好的基質中，用薄膜遮蓋，注意保濕，防止小苗過度失水。

１．２．３轉基因植株的分子檢測從生長到１ ｍ高左右的抗性植株和未轉化對照植株取葉片，用ＣＴＡＢ法［７］提取總ＤＮＡ作為模板進行ＰＣＲ擴增。ＰＣＲ引物Ｐ１和Ｐ２由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。Ｐ１：５′－ＡＧＴＴＧＡＴＡＡＧＧＴＣＴＣＴＴＣＧＴＴＧＡＴ

ＴＡＧＣＡＧ－３′；Ｐ２：５′－ＧＧＴＡＣＡＧＣＡＡＡＡＡＴＴＡＣＡＣＴＡ

ＡＧＡＧＧＣＡＡＧ－３′。

３０ μＬ ＰＣＲ反應體系：模板ＤＮＡ ３０ ｎｇ，上下游引物各０．５ μｍｏｌ，４種ｄＮＴＰ各１００ μｍｏｌ，１０×Ｂｕｆｆｅｒ ３ μＬ，Ｔａｑ酶２．５ Ｕ。反應程序為９５ ℃預變性５ ｍｉｎ；９４ ℃變性３０ ｓ、５５ ℃退火３０ ｓ、７２ ℃延伸３ ｍｉｎ，３５個循環；７２ ℃延伸１０ ｍｉｎ。ＰＣＲ反應產物進行１％瓊脂糖凝膠電泳，ＥＢ染色后觀察擴增結果并照相。

２結果與分析

２．１影響根癌農桿菌轉化玉米萌動胚的因素

２．１．１消毒時間對種子萌發的影響采用１ ｇ／Ｌ升汞，比較了６、８、１０、１２ ｍｉｎ消毒時間對種子萌發的影響。結果發現消毒時間８ ｍｉｎ較為適宜（基本沒有污染，萌發率在８５％以上），低于８ ｍｉｎ，玉米種子在隨后的實驗中，污染率較高。高于８ ｍｉｎ，隨著消毒時間的延長，種子的萌發率會明顯下降，１２ ｍｉｎ萌發率僅為６０％左右。可能是玉米種子經過３７ ℃水浴４～５ ｈ后已經開始萌發，對消毒劑比較敏感所致。

２．１．２潮霉素篩選濃度的確定實驗使用的植物表達載體ｐＣａＭＶＮＰＲ的Ｔ－ＤＮＡ區含有潮霉素磷酸轉移酶基因，因此用不同濃度潮霉素進行了抗性篩選實驗。潮霉素濃度太低容易出現假陽性植株，過高則影響植物正常生長發育。分別選擇含有０、２５、５０、７５、１００、１２５ ｍｇ／Ｌ潮霉素的ＭＳ培養基，每種培養基中接種１００粒玉米種子，進行濃度梯度實驗，重復３次。從表１可以看出，當潮霉素濃度高于５０ ｍｇ／Ｌ時，基本上玉米種子都喪失了發芽能力，選擇了４０ ｍｇ／Ｌ作為抗性篩選濃度，這樣既可避免假陽性植株的再生，又可使抗性植株正常生長（圖１）。

２．１．３浸染時間對轉化率的影響分別采用４、８、１２、１６、２４ ｈ浸染玉米萌動胚，經共培養和抗性篩選后統計抗性植株數。從表２可以看出浸染時間是影響抗性植株數即轉化率的一個重要因素。浸染時間過長過短都不利于萌動胚的轉化，浸染１２ ｈ轉化率最高（表２）。

２．１．４乙酰丁香酮對轉化率的影響設計了４個處理：①不加乙酰丁香酮的對照組，②在根癌農桿菌浸染液培育中加入１００ μｍｏｌ／Ｌ乙酰丁香酮，③在共培養階段加入１００ μｍｏｌ／Ｌ乙酰丁香酮，④在根癌農桿菌浸染液和共培養基中都加１００ μｍｏｌ／Ｌ乙酰丁香酮。實驗結果表明，添加１００ μｍｏｌ／Ｌ乙酰丁香酮可以提高轉化率，在菌液和共培養基中都加入乙酰丁香酮對提高轉化率效果最好（表３）。

研究共轉化玉米萌動胚３ ２００個，獲得抗性植株６２株，移栽后成活４２株（圖３），經潮霉素篩選獲得的抗性苗移栽種植高達１ ｍ左右時，取其新葉提取ＤＮＡ進行ＰＣＲ檢測，ＰＣＲ檢測結果表明４２株抗性苗中１６株為陽性植株，ＰＣＲ陽性植株率約為３８．１％。現有１６株陽性植株已經結實，其Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ等分子檢測有待進行。

３討論

根癌農桿菌作為自然界中存在的天然基因工程載體，具有操作方便、費用低廉、可插入片段大的外源基因、不易發生重排、拷貝數低且符合孟德爾遺傳規律等優點。但由于單子葉植物對根癌農桿菌不敏感，所以根癌農桿菌介導的遺傳轉化主要運用于雙子葉植物。自１９９４年Ｈｉｅｉ利用根癌農桿菌介導的方法［８］、１９９６年Ｉｓｈｉｄａ［９］、以及１９９７年Ｃｈｅｎｇ［１０］對水稻、玉米和小麥的轉化成功后，國內外學者對根癌農桿菌介導的玉米遺傳轉化進行了大量的研究，并且取得了明顯的進展［１１－１４］。

在轉化的受體系統方面，除了胚性愈傷組織外，成熟胚、莖尖、子房及花粉等都有成功的報道。各種受體系統都具有各自的特點，如胚性愈傷組織數量多，而且處于分生細胞狀態，易于接受外源基因，轉化率也較高。但再生植株嵌合現象嚴重。研究采用玉米成熟種子，使其處于萌發狀態以作受體，它具有實驗操作相對簡單、對實驗條件要求不是很高、不依賴組織培養技術、能夠較快得到轉基因植株、并且不受季節的限制等優點。其轉化原理可能是萌動的種胚對外界因子的作用十分敏感，胚性細胞開始處于分裂狀態，子葉對胚芽的包裹不再嚴密。此時利用高活力的根癌農桿菌浸染，將有利于對種胚生長點的轉化。加上對萌動種胚的切割處理，為根癌農桿菌進入種子，與生長點細胞接觸提供了通道，有利于轉化的實現［６］。

利用種子萌動胚為外植體進行遺傳轉化，獲得轉基因植株的方法雖然有其優點，但與其他受體系統進行根癌農桿菌介導的轉化方法一樣，轉化率也受到根癌農桿菌活化、浸染時間、共培養條件等多種因素的影響。因此，今后需要開展更深入的研究，以進一步提高轉化率。

參考文獻：

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注：本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內容請以PDF格式閱讀原文