囊胚期胚胎二次冷凍復蘇移植1例的出生結局和兒童發育情況隨訪

王雪，甄璟然，孫正怡，郁琦，鄧成艷，周遠征，王含必

(中國醫學科學院 北京協和醫學院 北京協和醫院婦產科生殖中心，北京 100730)

胚胎的冷凍保存是輔助生殖技術(ART)治療中的重要組成部分，通過冷凍保存可以將患者過多的胚胎保存下來，提高患者的累積妊娠率。胚胎的冷凍保存可以在胚胎發育的任意階段進行，如有的中心常規冷凍原核期胚胎或卵裂期胚胎，現在隨著培養體系的完善，越來越多的IVF中心進行囊胚培養以期提高妊娠率和降低多胎妊娠率，因此研究者更傾向于進行囊胚冷凍保存。冷凍方法可以為程序化慢速冷凍，也可以為玻璃化冷凍。我們中心自2004年起，對第3天移植后的胚胎全部進行囊胚培養，如有囊胚形成則進行玻璃化冷凍保存。然而在臨床工作中常存在一些偶發的意外情況，如患者在復蘇移植日因突發性原因無法進行胚胎移植，只能將復蘇的胚胎丟棄或再次冷凍后擇期復蘇移植。但是我們無法確定囊胚二次玻璃化冷凍后的安全性如何。目前關于人類胚胎二次冷凍的文獻較少，盡管有文獻報道了一些病例能夠在胚胎二次冷凍復蘇移植后獲得活產，但這些報道多為第一次冷凍為原核期胚胎或卵裂期胚胎，復蘇后培養至囊胚再次冷凍[1-4]。Kumasako等[3]認為二次冷凍不會降低胚胎的種植率，但是關于囊胚冷凍復蘇后再次冷凍復蘇移植的報道極少。且據我們所知，尚無研究來分析囊胚二次玻璃化冷凍復蘇移植后的出生結局。在此病例報道中，我們描述了囊胚二次冷凍復蘇移植后新生兒的出生結局，并對此患者的孩子進行長期隨訪觀察，詳細記錄了此兒童的體格發育情況。

一、臨床資料

患者34歲，丈夫35歲，因輸卵管因素原發不孕到我院生殖中心就診，不孕年限6年。根據世界衛生組織標準，男方精液參數正常。患者2005年在本中心進行卵巢刺激后取卵，在取卵周期所采用的促排卵方案按照本中心的常規進行，在上一周期的黃體期開始應用促性腺激素釋放激素激動劑(GnRH-a)，當垂體達到降調節后，用卵泡刺激素(FSH，果納芬，默克)進行卵巢刺激。當主導卵泡直徑達到18～20 mm時，注射人絨毛膜促性腺激素(HCG，艾澤，默克)，38 h后進行陰道超聲引導的卵泡穿刺來獲取卵母細胞。共獲得13枚卵母細胞，進行常規授精后，13枚卵母細胞受精，在受精后第3天觀察胚胎的卵裂情況，挑選2枚優質胚胎進行移植。移植后剩余的11枚卵裂期胚胎經患者知情同意后全部進行囊胚培養，在受精后第5日或第6日分別觀察囊胚形成情況及形態。采用Gardner評分系統對囊胚進行評分，該患者共形成2枚囊胚，囊胚評分分別為4BB和4BC。將所形成的囊胚按照我中心常規方法[5]進行玻璃化冷凍，具體操為：囊胚冷凍前進行人工皺縮，即用激光系統在遠離內細胞團的滋養細胞連接薄弱處打孔，讓囊腔液流出，使細胞皺縮成團；然后將囊胚放入含有7.5% DMSO和7.5%乙二醇的預平衡液中平衡2 min，之后移入玻璃化冷凍液中平衡30 s，將胚胎轉移至冷凍環(cryoloop環)上，直接浸入液氮保存。

患者新鮮周期移植未獲得妊娠，取卵3個月后患者進行冷凍囊胚復蘇移植。人工周期準備內膜，月經第2～4天行常規B超檢查，給予戊酸雌二醇(補佳樂，先靈，德國)口服，口服劑量根據患者以往的內膜情況調整(2～18 mg/d)。B超監測內膜生長情況，當內膜厚度達到8 mm時肌肉注射黃體酮(20 mg×2 d，40 mg×2 d，20～40 mg×1 d)，注射后第6天行囊胚復蘇移植。移植前1 d按照我中心常規方法[5]進行囊胚復蘇：準備囊胚復蘇液，在胚胎培養皿內配制0.33 mol/L、0.2 mol/L蔗糖溶液和基礎培養液(G-MOPS Plus，Vitrolife，瑞典)，從液氮中取出帶有囊胚的冷凍環，空氣中停留5 s后，將胚胎依次浸入上述復蘇液中，時間分別為2 min、3 min和5 min。復蘇后的2枚囊胚均進行激光輔助孵化，選擇在遠離細胞團的透明帶上部位切割透明帶的1/4左右。之后將囊胚移入提前準備好的囊胚培養液(G2，Vitrolife，瑞典)中，放置37℃、6%CO2和5%O2培養箱內培養16 h。移植前觀察囊胚的擴張和孵出情況。

該患者在囊胚復蘇移植日突發急性闌尾炎不能進行囊胚移植，在患者知情同意的前提下再次按照上述囊胚玻璃化冷凍操作步驟進行胚胎冷凍。患者手術6個月后再次進行冷凍囊胚復蘇移植，具體操作步驟同上，囊胚復蘇后16 h進行移植，患者成功妊娠，并于孕38周分娩一健康女嬰，體長52 cm，體重3 550 g。由于這是本中心第1例囊胚二次冷凍的患者，所以我們對其女進行了長期的隨訪。孩子的父親身高為185 cm，母親身高為167 cm；孩子1歲時，身高83 cm，體重12 kg；3歲時，身高97 cm，體重21 kg，身體健康，無疾病；5歲時，身高117 cm，體重31 kg；7歲時，身高135 cm，體重40 kg；9歲時身高154 cm，體重50 kg；12歲時，身高168 cm，體重62 kg；10歲時，乳房出現發育；12歲時月經初潮。該女孩性格開朗，參加學校管樂隊、校籃球隊等集體活動，并取得很好的成績，其智力正常，學習成績在班級前5名。

二、討論

在此病例中，患者獲得13枚成熟卵母細胞，13枚卵母細胞受精，經過培養后形成2枚囊胚并玻璃化冷凍保存。患者在預定囊胚復蘇移植日突發急性闌尾炎，在其知情同意的前提下將復蘇后的囊胚再次冷凍保存。此為臨床工作中一些難以避免的情況。如果將患者胚胎丟棄非常可惜，而胚胎再次冷凍保存的安全性尚不明確。到目前為止，雖然已經有一些胚胎在二次冷凍后獲得活產的病例報道，但都是第一次胚胎冷凍時為原核期或卵裂期胚胎，復蘇后培養至囊胚階段再次冷凍。本研究是首次對囊胚二次玻璃化冷凍后獲得的活產進行長期隨訪的病例報道。

有學者曾經用小鼠胚胎研究反復冷凍復蘇對胚胎的影響，他們發現與未冷凍的胚胎相比，冷凍胚胎在孵出時的細胞數略少，且小鼠胚胎能夠在成功的反復冷凍復蘇3次后仍然具有體外發育能力[6]。在此病例中，我們對比了兩次冷凍前后囊胚的形態學變化，第1次冷凍是在第5天，囊胚為4期，質量為4BB，第一次復蘇后培養16 h，囊胚完全孵出，成為6期囊胚，質量為6BB；第2次冷凍復蘇后，培養16 h囊胚質量為6BB。囊胚形態從外觀上看，兩次冷凍后沒有差異，囊胚細胞存活良好，貌似囊胚階段胚胎的二次玻璃化冷凍對胚胎的發育無太大影響。分析原因，我們認為可能與以下幾個方面有關。首先，囊胚在冷凍之前進行了激光皺縮，將囊胚腔內液全部放出，使囊胚腔塌陷，待囊胚完全皺縮后再進行囊胚的玻璃化冷凍，這樣能夠減少冷凍過程中冰晶的形成，降低對胚胎的損傷。有研究也證實囊胚的人工皺縮能夠有效提高囊胚冷凍后復蘇的存活率[7-9]。而且冷凍囊胚復蘇后的輔助孵化也非常重要，在胚胎冷凍過程中，人類囊胚的透明帶變硬，會限制胚胎的向外孵出，有研究認為囊胚在擴張過程中不斷地膨脹皺縮，如果在透明帶出口處卡的次數多了，囊胚就會衰亡[10]。而且，冷凍復蘇后的囊胚，由于剛剛復蘇后囊胚腔還處于皺縮狀態，胚胎和透明帶之間的間隙遠遠大于卵裂期胚胎的間隙，因此囊胚的輔助孵化更安全。我們的數據發現，未經過輔助孵化的囊胚，復蘇后過夜培養，完全孵出的比例(34%)遠低于激光孵化后的囊胚(85%)，更高的孵出比例意味著更高的著床機會。其次，囊胚的冷凍保存不同于卵裂期胚胎，它自身有很多優點。能夠發育至囊胚階段的胚胎經過二次選擇，發育能力異常的胚胎已經被淘汰；囊胚的細胞數目多，尤其是滋養細胞層細胞，損傷后修復能力強，少數細胞死亡后對胚胎發育能力影響小；囊胚的細胞更小，呈梭形，表面積/體積比大，對脫水、復水造成的體積變化耐受性更佳[11]。因此我們猜測囊胚二次冷凍后細胞沒有損傷的原因可能與此有關。

目前雖然有一些胚胎二次冷凍獲得活產的報道，但是對新生兒長期隨訪的報道非常少見。在此病例中，囊胚經過二次玻璃化冷凍后，仍然能夠成功種植，患者在足月分娩一正常體重的新生兒，也提示囊胚二次冷凍似乎并不影響新生兒的出生結局。復習文獻，我們發現在2011年的一項小型研究中，作者分析了一次冷凍和二次冷凍后胚胎出生結局的差異[12]。在文中一次冷凍，就是將2PN期或卵裂期的胚胎進行冷凍保存，復蘇后移植；二次冷凍指的是冷凍的胚胎復蘇后進行體外培養至囊胚階段，再進行冷凍。結果提示二次冷凍組的雙胎率低于一次冷凍組，他們認為是二次冷凍組移植的胚胎數較少造成的。此研究還提示二次冷凍組的出生體重略高于一次冷凍組，盡管沒有統計學差異；在二次冷凍組未發生先天異常，在一次冷凍組發生1例先天異常；兩組均未發生死胎或新生兒死亡。盡管這些并非囊胚二次冷凍的研究，但從一定程度上反映了胚胎在二次冷凍后并不影響新生兒的出生結局。我們對此新生兒隨訪至9歲，該兒童體格發育正常，智力發育正常，心理發育正常。與之前凍融胚胎移植(FET)出生兒童的隨訪結論一致[13-17]。Pelkonen等[13]分析了FET出生孩子的先天異常的發生情況，認為FET出生孩子發生先天異常的比例與新鮮移植相似，之后Pelkonen等[14]對FET后代孩子進行了一項隨訪3年的研究，發現FET與新鮮移植出生后代的體格發育是相似的。還有研究發現ART后出生后代的神經運動發育方面與自然妊娠后代無顯著差異，認為他們的神經發育、社會感情及語言學習并無差異[16-17]。可見胚胎冷凍對新生兒長期發育的影響與新鮮移植胚胎相似。而從我們的病例報道來看，囊胚的二次冷凍也是相對安全的。

我們將囊胚二次玻璃化冷凍后的胚胎進行移植后獲得成功妊娠，足月分娩一健康女嬰，并進行長達12年的隨訪，此兒童體格發育正常，智力發育正常，心理發育正常。認為此囊胚二次冷凍后胚胎仍然具有很好的種植潛能和發育潛能。但此病例僅為個例報道，囊胚反復冷凍是否會造成胚胎的損傷仍不明確，移植反復冷凍的胚胎是否安全還需要進一步的研究，因此在臨床工作中，我們仍應盡可能避免胚胎的反復凍融。