基質金屬蛋白酶檢測在非小細胞肺癌中的意義*

趙 璞，楊軍峰，何 苡

(河南省人民醫院胸外科一區,鄭州 450000)

肺部腫瘤是目前危害人類生命健康的重要病因之一，會產生巨大的醫療負擔和經濟壓力。隨著人口老齡化程度加劇及空氣質量的不斷惡化，肺癌發病率呈現逐年上升趨勢，目前已與肝癌、消化系統腫瘤共同成為城市居民死亡的重要病因[1]。癌癥細胞的局部浸潤和遠處轉移是腫瘤危害人體健康的主要手段，目前研究證實基質金屬蛋白酶(MMP)-2，-9，-14及調控MMP家族相關蛋白的信號素3A和FoxM1對腫瘤的局部浸潤和遠端轉移有明確的調控作用[2]。本研究將應用免疫組織化學技術，對非小細胞肺癌(NSCLC)患者手術切除的癌癥組織中MMP-9和MMP-14的表達水平進行檢測，同時對患者進行為期5年的臨床隨訪，探討MMP-9和MMP-14表達水平和患者預后的相關性，現報道如下。

1 資料方法

1.1一般資料 收集2010年6月16日至2011年8月9日于本院胸外科癌癥病房，接受肺癌根治性手術治療的NSCLC患者84例，納入患者均未接受術前放化療治療，其中男61例，女23例；年齡55～79歲；手術標本經病理切片認定為NSCLC，其中鱗狀細胞癌53例，腺癌29例，大細胞癌2例；結合薄層高分辨率CT診斷，并根據國際抗癌聯盟(UICC)制訂的第8版肺癌TNM分期標準[3]：本研究納入患者中T1a期15例，T1b期22例，T1c期15例，T2a期16例，T2b期7例，T3期7例，T4期2例；N0期68例，N1期12例，N2期4例，M0期84例；TNM分期ⅠA期41例，ⅠB期15例，ⅡA期5例，ⅡB期16例，ⅢA期7例。免疫組織化學檢測用兔抗人MMP-9和MMP-14多克隆抗體購置于Sigmaaldrich公司，免疫組織化學試劑盒購置于武漢谷歌生物技術有限公司。

1.2方法

1.2.1病理標本采集 患者行薄層高分辨率CT檢查確定病變部位及病變分期，待術前檢查完善，一般情況穩定后行肺癌根治性手術治療。完整切除病變后取10%切緣組織進行術中冰凍病理切片檢查，取10%癌組織甲醛固定，常規進行石蠟包埋處理以備后續實驗，剩余組織于液氮中保存。另收集良性肺部病變接受手術切除組織作為陰性對照，收集病例分型為鱗癌和腺癌的胃癌標本作為陽性對照。患者術后常規接受化療，每半年隨訪一次并復查CT，記錄手術至死亡時間，計算生存率。本研究納入患者全部簽署知情同意書，治療過程依從性良好，無患者失訪。

1.2.2實驗方法 根據免疫組織化學試劑盒相關說明，并結合文獻[4]進行操作，癌癥組織經石蠟包埋后以4 μmol/L厚度連續切片，常規進行脫蠟、脫水后，用枸櫞酸進行抗原修復5 min，用3%甲醇過氧化氫液阻斷20 min。兔抗人MMP-9和兔抗人MMP-14多克隆抗體1∶200稀釋，一抗37 ℃孵育60 min，二抗37 ℃孵育30 min，二氨及聯苯胺(DAB)顯色、蘇木素復染并用透明樹膠封片。陰性對照及陽性對照組織采用相同處理。

1.2.3判定標準 抗原抗體相結合將產生棕黃色顆粒狀免疫復合物定義為陽性產物。于高倍鏡下觀察細胞，可見陽性產物多聚集于細胞表面或細胞質內，較少見于細胞核。根據每個細胞中的陽性產物的染色強度及出現范圍確定陽性細胞，當400倍鏡若干視野中，每200個細胞中陽性細胞數量大于50個，即陽性腫瘤細胞數大于25%時，記為該組織中MMP-9或MMP-14呈陽性表達。

2 結 果

2.1MMP-9與MMP-14表達與患者性別和病理分型的關系 在性別方面，MMP-9與MMP-14表達差異無統計學意義。MMP-9和MMP-14陽性表達率與組織分型無關，見表1。

2.2MMP-9表達與癌細胞TNM分期的相關性 在T2和T3～4期與T1期細胞中MMP-9表達量對比差異有統計學意義；N0組中MMP-9陽性率(48.5%)明顯低于N1～3期陽性率(87.5%)； MMP-9在Ⅱ期和Ⅲ期細胞中表達量也明顯較Ⅰ期細胞高。在TNM分期的組間對比中，MMP-14差異無統計學意義。MMP-14與細胞N分期不具有相關性，見表2。

2.3MMP-9與癌癥復發及生存率的相關性 5年內癌癥復發患者MMP-9陽性率明顯高于未復發患者；MMP-14的表達差異在患者5年內復發方面差異有統計學意義；在復發患者MMP-14陽性率明顯高于未復發患者，在出現轉移病灶患者中高達100%，且MMP-14表達率與患者5年生存率無相關性,MMP-9與癌癥復發及生存率有相關性，見表3。

表1 MMP-9及MMP-14蛋白表達與患者性別及組織分型的關系[n(%)]

表2 MMP-9及MMP-14蛋白表達與TNM分期的關系[n(%)]

a：P<0.05，與T1期比較；b：P<0.05，與Ⅰ期比較

表3 MMP-9及MMP-14蛋白表達與癌癥復發及患者生存率的關系[n(%)]

3 討 論

基質金屬蛋白酶家族(MMPs)目前已經分離鑒定出26種亞型，分為膠原酶、活化型MMP、分泌性MMP、明膠酶、基質降解素和基質溶解素6大類[5]，MMP-9屬于金屬蛋白酶家族中明膠酶，該家族蛋白在保持生物活性時需要鋅離子的存在，同時鈣離子也可以有效維持其穩定性，因該蛋白需要金屬離子的輔助作用而得名。該蛋白家族內部結構相似，主要由5個不同的功能結構域組成，包括疏水信號肽區、前肽區、催化活性區、鉸鏈區和羥基末端，其中前肽區是MMP蛋白酶原被外源性切酶激活的主要位點，而催化活性區則具有高度的保守性。MMP家族成員雖然在基礎結構方面有較大差異，但都以細胞外基質為主要消化底物，同一種MMP對多種細胞外基質有效，但酶解效率有較大差異，因該蛋白具有降解細胞外基質蛋白的功能，能夠有效破壞癌癥細胞浸潤和遠端轉移的組織屏障，因此在腫瘤的侵襲中起到了至關重要的作用。

細胞外基質(ECM)是存在于細胞外，主要維持細胞正常生理活性，由膠原和蛋白聚糖等生物大分子構成的網絡框架，這些大分子通過細胞表面的特異性受體，與細胞骨架相連接，參與細胞生理活動。MMP-9因屬于明膠酶，對細胞外基質中明膠，Ⅳ和Ⅴ型膠原蛋白極強的水解作用，MMP-14則屬于Ⅳ膜型MMPs蛋白，主要的水解產物是酶原型MMP-2，可以有效激活細胞表面MMP-2蛋白，MMP-2屬于Ⅱ型明膠原酶，對Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ型膠原蛋白和彈性蛋白有強烈的水解作用[6]。總而言之，MMP-9和MMP-14的激活，對細胞外基質可以產生嚴重的破壞作用，損傷正常組織對腫瘤的屏障功能，是癌癥細胞侵襲力增加，導致腫瘤組織轉移的重要因素。有研究顯示，乳腺癌細胞腦轉移與MMP-2和MMP-9表達增高有關，肺癌的局部浸潤與MMPs表達增高也有明顯相關性[7]。在本研究中也發現，MMP-14在T2期癌細胞中表達的陽性率為95.7%，明顯高于T1組細胞，可以說腫瘤細胞的大小與MMP-14 表達有明顯相關性，但與癌癥細胞是否出現淋巴結轉移則無明顯統計學相關性，可以說明，MMP-14主要激活MMP-2，增強了對局部組織的破壞程度，更有利于腫瘤組織的局部侵害性[8]。但由于大細胞癌比例較小，仍需要大樣本研究證實該結果。

MMPs表達升高有利于腫瘤侵襲和轉移的另一個重要原因是，MMPs對細胞外基質進行降解的同時，有效清除了血管內皮細胞向正常組織中浸潤的有效屏障，而血管生成則是腫瘤細胞快速生長，向遠端組織侵襲并定植的主要推動者[9-11]。在本研究中發現，MMP-9的表達，與腫瘤的T分期有明顯相關性，T2期和T3～4期的腫瘤組織中表達明顯高于T1期腫瘤組織，且淋巴結轉移患者的肺癌組織中，MMP-9表達也明顯升高，術后5年內復發的患者中，11例出現了遠端轉移的新病灶，而組織張MMP-9表達陽性率明顯增高，也說明MMP-9對細胞外基質的破壞作用。MMP-9和MMP-14的表達增高對患者的預后也有判斷價值，5年內復發的23例病例中，MMP-9陽性率為82.6%，MMP-14陽性率為95.7%，都明顯高于未復發患者中的表達，而出現遠端病灶的患者中，MMP-9和MMP-14表達陽性率高達100.0%，盡管與未出現MMP-9和MMP-14陽性表達的患者比例差異無統計學意義，但也高于其71.4%和92.9%的比例，可以說，MMP-9與MMP-14對非小細胞肺癌患者的預后預測有臨床意義[12]。

MMPs活性受金屬基質蛋白酶組織抑制因子(TIMPs)的抑制作用，但由于其體外提純難度較大和體內合成有收到多種蛋白信號通路調控，作為藥物用于臨床抑制癌癥侵襲仍有較大難度[13]。目前已知的具有抑制MMPs生物功能的物質有長鏈不飽和脂肪酸，其長鏈結構對MMP-2與纖維蛋白原結合域有干擾作用；多酚和黃酮類化合物也對MMP-2，-7，-9和-14抑制作用明顯，并可以參與細胞信號轉導，調控細胞遷移能力，其中具有代表性的就是咖啡酸，一種廣泛存在于橄欖油、咖啡、水果和蔬菜中的多酚類化合物[14-15]。健康豐富的飲食習慣也可以從一定程度上預防癌癥的發生和進展。

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