EGFL-7介導的促血管生成作用在嬰幼兒血管瘤中的作用及干預分析

王 勝，王勝春，李 琳，李真真

(鄭州大學附屬兒童醫院/河南省兒童醫院/鄭州兒童醫院皮膚科,鄭州 450018)

嬰幼兒時期也存在比較常見的皮膚良性腫瘤，比如嬰幼兒血管瘤，多發于女童，主要發病部位為頭部和頸部的皮膚。血管內皮異常增生導致了嬰幼兒血管瘤的發生[1]，一般而言，嬰幼兒血管瘤的臨床病理分期主要是增生期、消退期和消退完成期。就目前而言，嬰幼兒血管瘤的發病機制尚未完全清楚，但近年來關于血管瘤新生血管的信號通路的問題引起了廣泛討論。表皮生長因子樣結構域7(EGFL-7)是一種由內皮細胞分泌的特異性生長因子類似物，可控制內皮細胞的成管、增殖等生理過程，在胚胎發育過程及成人富含血管組織中，如肺、卵巢和腎臟中均呈高水平表達[2]。有研究發現，在增生期血管瘤瘤體中EGFL-7的表達量較高[3]。本研究選取50例血管瘤嬰幼兒的組織標本及30例患兒為研究對象，探討EGFL-7介導的促血管生成作用在嬰幼兒血管瘤中的作用及干預措施，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集本院2013年2月至2016年3月嬰幼兒血管瘤的50例石蠟組織標本，本研究已經通過本院倫理委員會審批，且均經家屬或監護人同意，并簽署知情同意書。其中男17例，女33例；年齡2.5～9.0個月，平均(7.5±2.2)個月。將以上石蠟標本根據患兒臨床表現、病史、B超及蘇木素-伊紅(HE)染色，按照Takahashi和Mulliken分類法將血管瘤分為3組：增生期組、消退期組、消退完成期組，分別有14、25、11例。采用自身對照設計，選取5例癌旁正常組織作為對照組。選取同期收治的30例增生期血管瘤患兒為研究對象，納入標準：(1)均符合增生期血管瘤的診斷標準，并經局部增強CT或超聲確診；(2)家屬均同意采用普萘洛爾治療，并簽署知情同意書；(3)患兒之前未接受過任何血管瘤的治療；(4)年齡大于1個月；(5)血管瘤直徑大于1.0 cm；(6)病變部位主要位于顏面部、頸部等部位，均為淺表型血管瘤；(7)完善相關輔助檢查排除絕對禁忌證。排除標準：(1)合并有呼吸道疾病，如肺炎、支氣管炎、支氣管哮喘等疾病；(2)合并有心血管疾病，如心源性休克、Ⅱ～Ⅲ度房室傳導阻滯、竇性心率過緩等；(3)過敏或合并別的疾病；(4)治療依從性較差。其中男10例，女20例。年齡2.4～11.0個月，平均(8.2±2.5)個月。血管瘤部位：頜面部26例，軀干3例，四肢1例。

1.2儀器、設備及試劑

1.2.1儀器及設備 本研究的實驗儀器主要有光學顯微鏡(OLYMPUS，美國)，顯微鏡拍照系統和石蠟切片機(Leica，德國)，高速冷凍離心機(herexi HR/T20MM 湖南)，還有紫外分光光度計(T6 北京普析)等。實驗設備主要包括SW-CJ-2FD超凈工作臺(蘇凈，中國)；BioTek Power WaveXS2全波長酶標儀(BioTek寶特，美國)；Cobas 6000 C501 Roche 生物顯微鏡(Roche，日本)；全自動高壓蒸汽滅菌器(予騰，上海)；倒置熒光顯微鏡(OLYMPUS，美國)；DK-522-電熱恒溫水浴鍋(精宏實驗設備，上海)等。

1.2.2試劑 磷酸鹽緩沖液(PBS)，4%多聚甲醛，鹽酸乙醇，50%、75%、85%、95%乙醇，30%過氧化氫，無水乙醇Ⅰ和Ⅱ，二甲苯，二甲苯Ⅰ和Ⅱ，蘇木素，免疫組織化學SABC試劑盒購自(賽默飛世爾，中國)；抗EGFL-7鼠抗人單克隆抗體和EGFL-7 ELISA試劑盒(賽默飛世爾，中國)。

1.3方法

1.3.1HE染色 制作好的蠟塊標本經4 μm連續切片，逐步靠近切片組織所在部位。然后拿防脫載玻片將切好的成連續狀的蠟片用鑷子夾入溫水箱里，撈片，之后烘片。切片常規二甲苯脫蠟，將組織切片浸泡于pH 6.0的PBS中采用微波爐30 min修復抗原。3%過氧化氫室溫孵育10 min，消除內源性過氧化物酶的活性。將制作好的玻片一部分用于HE染色，一部分用于免疫組織化學染色。

1.3.2免疫組織化學 制作好的蠟塊標本經4 μm連續切片，制作免疫組織化學切片。取上述制作好的切片，加入了一抗，在4 ℃的溫度下放置過夜，然后進行40 min的復溫，并用PBS將其沖洗(3次，每次2 min)，然后再加入二抗，并且在室內常溫下進行30 min的孵育，PBS沖洗(3次，每次2 min)；然后滴加SABC工作液，顯色510 min后采用蘇木素復染，見標本變紅后水洗5 min。脫水晾干，透明樹膠封片。按照試劑盒說明的免疫組織化學實驗步驟檢測組織內EGFL-7蛋白的表達情況。免疫組織化學的結果判定：每個標本取3張不同層面的切片，陽性細胞為胞質或胞膜出現棕黃色顆粒[4]。在400倍光鏡下采用Olympus圖像采集系統，對陽性區域進行半定量分析。

1.3.3干預方法 口服普萘洛爾干預血管瘤(天津力生制藥廠生產)，劑量按照患兒的年齡設定。對于小于3個月的患兒口服劑量為0.5 mg/kg，3～6個月大小劑量為1 mg/kg，>6個月的患兒劑量為2 mg/kg。治療初期患兒入院觀察3～5 d。治療時間為4～8個月。治療期間注意觀察患兒的血壓、心率及其他不良反應。于治療前及治療后12個月檢測患兒血清、尿液中EGFL-7表達的變化。具體方法為：收集患兒的外周靜脈血及尿樣本。將全血及尿液標準置于室溫下靜置2 h后離心機離心15 min，取上清液用于指標檢測。EGFL-7表達采用酶聯免疫吸附試驗-雙抗夾心法測定，按照試劑盒的操作說明進行：將樣品稀釋，標準品、洗液工作液、辣根過氧化物酶標記物工作液配置好后進行加樣，之后加入酶標抗體，然后底物顯色。波長450 nm處測定各孔的吸光度(A)值，單位為μg/mL。

2 結 果

2.1血管瘤增生期組織的HE染色與正常皮膚組織比較 增生期血管瘤組織切片(圖1A)管腔不明顯，血管結構紊亂，細胞核大，染色深，可見核分裂，內皮細胞排列紊亂。與正常皮膚組織切片(圖1B)相比細胞密度增加，間隔細胞少，形狀不規則，成膨脹性向外生長。

2.2EGFL-7在各期血管瘤中的表達 EGFL-7在增生期與消退期組的表達高于消退完成期組和對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。EGFL-7在消退完成期組與對照組中的表達差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。EGFL-7在增生期成強陽性或陽性表達(圖2A)，在消退期呈陽性表達(圖2B)，在消退完成期呈弱陽性或陰性表達(圖2C)，在對照組呈陰性表達(圖2D)。

A:增生期血管瘤組織； B：正常皮膚組織

圖1 組織HE染色(×100)表1 EGFL-7在各期血管瘤中的表達

a：P<0.05，與對照組比較

A:增生期組；B：消退期組；C：消退完成期組；D：對照組

圖2 EGFL-7在各組中表達情況

2.3普洛萘爾干預前后血管瘤患者EGFL-7的表達情況 血管瘤的患兒經普萘洛爾干預后血清、尿液中的EGFL-7均低于干預前，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 普洛萘爾干預前后血管瘤患者EGFL-7的表達情況(μg/mL)

a：P<0.05，與干預后比較

3 討 論

血管瘤是以內皮細胞增生為特征的腫瘤，在新生兒中的發病率為1%～2%，在1歲時的嬰幼兒發病率為10%～20%，可呈快速進展狀態，半年內瘤體增生異常迅速，此后逐漸減慢。在血管瘤的病程進展過程中，血管內皮細胞由增生期不成熟的內皮細胞逐漸變成熟，但其具體機制并不清楚。EGFL-7是定位于人類9號染色體上的一個內皮特異性基因，包含2個生長因子類似的結構域[5]。EGFL-7是在2003年被發現，是一種血管生成的必需因子，特異性表達于內皮細胞系統，在促進內皮細胞增殖、遷移、出芽、黏附過程中有重要作用。近幾年的研究發現，EGFL-7能夠促進生理性和病理性的管腔形成、功能完善，在富含血管的組織和器官中有表達，而在正常成年組織中不表達或表達下調，該蛋白可以被激活，參與血管生成[6]。本研究結果顯示，EGFL-7在嬰幼兒血管瘤的增生期與消退期的表達高于消退完成期組和正常皮膚(P<0.05)。EGFL-7在消退完成期與正常皮膚中的表達差異無統計學意義(P>0.05)。這提示EGFL-7參與嬰幼兒血管瘤的病情進展。

EGFL-7在內皮細胞上的表達可阻止平滑肌細胞遷出，使內皮細胞運動遷徙能力過度增強，維持腫瘤血管的穩定性[7]。有研究指出EGFL-7在組織擴增期的脈管系統中高表達，與本研究的結論基本一致。EGFL-7并不能刺激內皮細胞的增殖，而是通過促進血管內皮的遷徙，對內皮細胞黏附進行調節，并且還對血管平滑肌進行遷移抑制，以此來對腫瘤血管的發展起到維持的作用。因此，有研究推測，通過阻斷或干擾血管瘤血管細胞EGFL-7的表達，可以阻止血管瘤微血管的形成，抑制血管生成和侵襲轉移，達到治療的目的[8]。普萘洛爾屬于β腎上腺素能受體拮抗藥，以往常用于心血管系統疾病的防治。但普萘洛爾于2008年被報道用于嬰幼兒血管瘤的治療中，并證實具有見效迅速、療效顯著、不良反應少等優點，所以其在嬰幼兒血管瘤的治療藥物中逐漸成為了一線藥物，替代了激素[9]。目前關于普萘洛爾治療嬰幼兒血管瘤的機制尚未有能被普遍接受的觀點。有研究顯示，普萘洛爾能夠顯著降低增殖期嬰幼兒血管瘤患者外周血清和尿液中EGFL7水平，并認為這可能是普萘洛爾的治療機制之一[10]。本研究通過對普萘洛爾干預治療的血管瘤患兒的血液及尿液中的EGFL-7的表達情況進行檢測發現，普萘洛爾能夠下調血管瘤患兒EGFL-7的表達水平，與干預前比較差異有統計學意義。與上述研究結論基本一致。這提示普萘洛爾作用于增殖期血管瘤的作用機制中，最關鍵的可能是對EGFL-7的表達發生了抑制，然后間接影響血管的穩定性及血管床的構建，發揮血管增殖的抑制效果，促進血管瘤體的消退，達到治療作用[11]。

綜上所述，EGFL-7與血管生成有關，血管瘤組織中期表達顯著增高，但經普萘洛爾干預后EGFL-7水平顯著下降，這可能成為血管瘤干預的重要機制。

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