MiR-650通過靶向ING4促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞增殖的研究*

陳賢明，張 森，王愛民，王子明

(陸軍軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所骨科，重慶 400042)

骨肉瘤是兒童和青年人群中最常見的原發(fā)性骨腫瘤，占原發(fā)性骨腫瘤的20%[1-2]。遺傳學(xué)的改變與骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展有著緊密的聯(lián)系，因此尋找一個重要的基因治療靶標(biāo)成為了人們關(guān)注的重點。微小RNA(miRNA)是一類小非編碼RNA分子，大量的研究已經(jīng)證實miRNA參與了多種生物學(xué)進(jìn)程，包括細(xì)胞增殖、分化、凋亡等[3-4]。近年有研究發(fā)現(xiàn)，miR-650在包括胃癌、肝癌、肺腺癌等多種腫瘤組織中都有著高表達(dá)，并且參與了細(xì)胞的異常增殖[5-9]，提示其可能是一種潛在的促癌因子。本研究用實時熒光定量PCR的方法檢測了骨肉瘤患者組織及人骨肉瘤細(xì)胞系中miR-650的表達(dá)情況，同時檢測在抑制miR-650后人骨肉瘤細(xì)胞增殖情況的變化并探討可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1主要材料 骨肉瘤組織及癌旁正常組織收自本科室治療患者，共計4例：1號病例為男性，19歲，發(fā)病于右側(cè)股骨遠(yuǎn)端，大小約7 cm×9 cm，ⅠB期，為軟骨母細(xì)胞型骨肉瘤；2號病例為男性，17歲，發(fā)病于左側(cè)股骨遠(yuǎn)端，大小約2 cm×2 cm，ⅠA期，為骨母細(xì)胞型骨肉瘤；3號病例為女性，14歲，發(fā)病于左腓骨小頭，大小約3 cm×5 cm，ⅡA期，為骨母細(xì)胞型骨肉瘤；4號病例為女性，21歲，發(fā)病于右側(cè)股骨遠(yuǎn)端，大小約3 cm×6 cm，ⅠB期，為纖維母細(xì)胞型骨肉瘤。樣本搜集在經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審查通過，患者簽署知情同意書后進(jìn)行。人骨肉瘤細(xì)胞系MG63及健康人成骨細(xì)胞系hFOB1.19購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫，RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibico,美國)、轉(zhuǎn)染用培養(yǎng)基OPTI MEMI(Gibico,美國)、胎牛血清(Gibico,美國)、Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen,美國)、細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo,美國)、TRIzol(Invitrgen,美國)、RIPA裂解液(碧云天，江蘇)、TRIzol試劑(Invitrogen,美國)、四甲基偶氮唑鹽(MTT,Sigma,美國)、miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒(天根公司，北京)、抗體(Santa cruz,美國)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) MG63細(xì)胞及hFOB1.19均用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃、含5% CO2氣體、濕度飽和的培養(yǎng)箱中。2～3 d換液1次。取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.2.2MiR-650抑制劑及ING4 siRNA轉(zhuǎn)染 采用Lipofectamine 2000試劑對MG63細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，在轉(zhuǎn)染24 h后用qPCR的方法檢測MG63細(xì)胞中miR-650的表達(dá)情況。將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞接種到6孔板中，設(shè)置陰性對照組(NC)、亂序組及miR-650抑制劑組。轉(zhuǎn)染步驟根據(jù)Lipofectamine 2000試劑盒說明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染后24 h通過qPCR進(jìn)行驗證轉(zhuǎn)染效率。MiR-650抑制劑及ING4 siRNA購自銳博生物科技有限公司(廣州)，miR-650抑制劑序列為5′-GTC CTG AGA GCG CTG CCT CCT-3′，ING siRNA序列為5′-GCC ACT GAG TAT ATG AGT A-3′。

1.2.3RNA提取與實時熒光定量PCR分析 收集了4例骨肉瘤患者的骨肉瘤組織及癌旁正常組織，并用qPCR的方法測定了4對組織的miR-650表達(dá)情況。同時對比了健康人成骨細(xì)胞系(hFOB 1.19)及人骨肉瘤細(xì)胞系(MG63)中miR-650的表達(dá)情況。按照TRIzol試劑說明書，提取細(xì)胞總RNA。測定A260 nm/A280 nm，以檢測總RNA的濃度及純度。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書的步驟將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。用q-PCR的方法檢測miR-650及ING4水平。其中miRNA-650的上游引物為：5′-AGA GGA GGC AGC GCT CT-3′，下游引物為：5′-CAG TGC GTG TCG TGG AGT-3′；內(nèi)參U6的上游引物為：5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′，下游引物為：5′-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3′；ING4的上游引物為：5′-TTT CAG AGG GAG GGT CCT TT-3′，下游引物為：5′-GCC AGA GCC TAG ATG ACC TG-3′；β-actin的上游引物為：5′-AAA GAC CTG TAC GCC AAC AC-3′，下游引物為：5′-GTC ATA CTC CTG CTT GCT GAT-3′。反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性5 min；隨后95 ℃ 15 s變性，59 ℃ 30 s退火，72 ℃ 30 s延伸及檢測。通過Ct值及計算2-ΔΔCt得到其相對表達(dá)量。

1.2.4細(xì)胞增殖實驗 將MG63細(xì)胞以每孔5×103個細(xì)胞的數(shù)量接種于96孔板中，在指定的時間點加入20 μL無菌MTT染料(5 mg/mL,Sigma，美國)，于37 ℃中孵育4 h，隨后移除培養(yǎng)基，加入150 μL二甲基亞砜，并在室溫?fù)u床上搖10 min。測量490 nm波長的A。

1.2.5Western blot檢測ING4蛋白的表達(dá) 用RIPA裂解液對細(xì)胞進(jìn)行裂解，刮取細(xì)胞懸液用超聲處理10～15 s，在冰上裂解1 h后，12 000×g離心30 min，收集上清液。用BCA法對蛋白濃度進(jìn)行測定，隨后在蛋白樣本中加入上樣緩沖液，于沸水中煮5 min，-20 ℃保存。在Western blot實驗中，用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)對蛋白樣品進(jìn)行分離后，將蛋白用半干轉(zhuǎn)膜的方法將蛋白轉(zhuǎn)移到NC膜上。用5%的脫脂奶粉進(jìn)行封閉。隨后加入1∶200比例稀釋的ING4一抗(Santa cruz)，4 ℃過夜。用TBST清洗膜3次后，用相應(yīng)的熒光二抗孵育1 h。隨后用Odyssey激光成像系統(tǒng)(LI-COR,Lincoln,美國)進(jìn)行掃膜成像。結(jié)果用ING4/GAPDH的比值來表示。

2 結(jié) 果

2.1miR-650在骨肉瘤細(xì)胞系中表達(dá)升高 在骨肉瘤組織中的miR-650表達(dá)量顯著高于癌旁正常組織，見圖1；同時MG63細(xì)胞中miR-650的表達(dá)也顯著高于hFOB 1.19細(xì)胞(1.00±0.17vs. 4.27±0.23)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

1：1號病例；2：2號病例；3：3號病例；4：4號病例；a:P<0.05

圖1患者的骨肉瘤組織和癌旁組織中miR-650的表達(dá)情況

2.2miR-650抑制劑對miR-650表達(dá)的抑制效率 miR-650抑制劑組miR-650的表達(dá)量為0.32±0.14，較陰性對照組(1.00±0.15)、亂序組(1.02±0.1)顯著降低且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.3抑制miR-650后，MG63細(xì)胞增殖顯著減弱 相對于亂序組和對照組，抑制miR-650后在48、72、96 h時，MG63細(xì)胞的增殖能力均顯著受到抑制，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

a：P<0.05，與對照組比較；b:P<0.05,與亂序組比較

圖2抑制miR-650后MG63細(xì)胞的增殖情況

2.4抑制miR-650后ING4 mRNA及蛋白表達(dá)顯著升高 相對于對照組和亂序組，在miR-650抑制劑組，ING4的mRNA水平和蛋白表達(dá)水平均顯著升高(mRNA表達(dá)分別為1.00±0.16、1.08±0.14、5.35±0.32；蛋白表達(dá)分別為0.62±0.06、0.59±0.12、2.45±0.20)，見圖3。

A:抑制miR-650后ING4的mRNA表達(dá)情況；B：抑制miR-650后ING4的蛋白表達(dá)情況；a:P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05,與亂序組比較

圖3抑制miR-650后ING4的mRNA及蛋白表達(dá)情況

2.5siRNA干擾ING4 mRNA表達(dá)后，抑制miR-650后對MG63細(xì)胞增殖的抑制作用 在干擾ING4后，ING4的mRNA水平顯著降低；而在干擾掉ING4后，抑制miR-650降低MG63增殖的作用顯著減弱，且在72 h及96 h處差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05) ，見圖4。

a：P<0.05，與miR-650抑制劑組比較

圖4 miR-650抑制細(xì)胞增殖的能力比較

3 討 論

大量的研究已經(jīng)證實，miRNA在腫瘤組織中的表達(dá)譜與對應(yīng)正常組織有著顯著的差異，并且這種差異與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[10-12]。miR-650 在多種腫瘤組織中都有著高表達(dá)，提示其可能是潛在的促癌因子。ZENG等[13]和ZHANG等[4]分別發(fā)現(xiàn)miR-650促肝癌及胃癌形成的作用與其靶向ING4有關(guān)。為了研究miR-650在骨肉瘤中是否也發(fā)揮同樣的促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生成的作用，本研究對其在骨肉瘤細(xì)胞系MG63細(xì)胞的增殖情況進(jìn)行了研究。在本研究中，證實了miR-650在骨肉瘤細(xì)胞系中表達(dá)較正常成骨細(xì)胞中升高，提示miR-650與骨肉瘤有著密切的聯(lián)系。而隨后的研究中發(fā)現(xiàn)抑制miR-650后可以顯著降低MG63細(xì)胞的增殖，說明miR-650可能參與了骨肉瘤的發(fā)生及腫瘤組織的快速增殖。

miR-650參與了MG63細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)，是通過什么機(jī)制完成的呢？有研究認(rèn)為miR-650可以通過抑制包括肝癌及胃癌等腫瘤細(xì)胞中的ING4發(fā)揮促腫瘤形成的作用。ING4是一種新的腫瘤抑制基因家族的一員，近年來有多項研究證實ING4在人骨肉瘤的發(fā)病過程中扮演了重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)ING4能與p53相互作用并增強其功能。而p53是一種已經(jīng)被廣泛研究的抑癌基因，它可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡防止癌變，同時協(xié)助修復(fù)受損DNA，所以增強p53功能對腫瘤抑制有著重要的意義。此外， ING4還能直接阻斷NF-κB信號通路，從另一個途徑抑制腫瘤的生成與侵襲。ING4可能通過多個通路對腫瘤的發(fā)生及轉(zhuǎn)移發(fā)揮抑制作用，因此也成了抑制腫瘤的熱門靶點。miR-650已經(jīng)在多項研究中證實可以調(diào)節(jié)ING4的表達(dá)，但在骨肉瘤細(xì)胞中尚未有研究，因此，為了探索miR-650促進(jìn)MG63細(xì)胞促癌作用是否與ING4有關(guān)，本研究檢測了在抑制miR-650后ING4的mRNA和蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果證實抑制miR-650后，MG63細(xì)胞中ING4的mRNA和蛋白的表達(dá)水平都顯著升高，提示miR-650可以在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平降低ING4的表達(dá)。ING4是否是介導(dǎo)了miR-650調(diào)節(jié)MG63細(xì)胞增殖？為了證實這個問題，本研究用siRNA抑制了ING4的表達(dá)，隨后觀察了miR-650抑制劑對MG63細(xì)胞增殖的抑制作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制ING4表達(dá)后，miR-650抑制劑對MG63細(xì)胞增殖的抑制作用顯著減弱，提示ING4在miR-650對MG63細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要的作用。本研究結(jié)果提示miR-650可能通過ING4調(diào)節(jié)骨肉瘤細(xì)胞的增殖，為骨肉瘤的治療提供了新的靶點和思路。

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