2種注射液的無菌檢查法的建立與驗證

方劍儒 張連鋼 薛曉莉

（1張掖市食品藥品檢驗檢測中心 甘肅 張掖 734000）（2嘉峪關市食品藥品和醫療器械檢驗檢測中心 甘肅 嘉峪關 730020）

注射液的無菌檢查是保證藥品使用安全的一個重要方面，選擇合適的試驗方法，才能保證藥品的質量要求。呋塞米注射液為利尿劑，異煙肼注射液是抗結核藥，同作為本單位第二季度的基本藥物品種，由于生產企業未提供無菌檢驗適用性試驗的方法，為保證無菌檢驗結果的準確可靠，確認采用的方法適合于各供試品的無菌檢查[2]，筆者對2種注射液的無菌檢查法分別進行了方法適用性驗證，以保證所采用的方法適合于該2種注射液的無菌檢查。

1.儀器與試藥

1.1 試驗儀器

GJ-204A型潔凈工作臺（江蘇無錫市威達凈化空調電氣設備廠）、一次性全封閉集菌培養器、Htysteritest601型智能集菌儀（杭州泰林生物技術設備有限公司）、SPX-250型生化培養箱（上海躍進醫療器械有限公司）、SPX-150型生化培養箱（惠科電子有限公司）。

表 試驗組與陽性試驗組觀察結果

1.2 試驗樣品

呋塞米注射液（遂成藥業股份有限公司：批號：1702172；上海禾豐制藥有限公司：批號：34161102）；異煙肼注射液（西南藥業股份有限公司：批號：170411，170413）。

1.3 試驗試劑

胰酪大豆胨液體培養基（批號 20150914）、沙氏葡萄糖液體培養基（批號 20150722）、硫乙醇酸鹽硫體培養基（批號20150104）、pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液（批號 20160715），以上培養基均由青島高科園海博生物制品購買。

1.4 試驗菌株

黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B)26003]、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)[CMCC(B)10104]、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) [CMCC(B)63501]、大腸埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B)44102]、白念珠菌(Candida—albicans)[CMCC(F)98001]、黑曲霉(Aspergillusniger) [CMCC(F)98003]，均為第2代菌株，以上菌株均由中檢院購買。

2.方法與結果

2.1 菌液制備

接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌的新鮮培養物至胰酪胨大豆胨液體培養基中，30～35℃培養18～24h，接種白色念珠菌的新鮮培養物至沙氏葡萄糖液體培養基中，20～25℃培養24～48h，接種黑曲霉的新鮮培養物至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養液上，20～25℃培養5～6d，經含0.05%聚山梨酯80的無菌pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液5mL清洗孢子，將孢子懸液吸出轉移至無菌試管內，用含0.05%聚山梨酯80的pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液稀釋成每毫升含孢子數小于100cfu的孢子懸液。上述菌懸液經培養計數，菌落數均在10～100cfu/ml之間。

2.2 方法學驗證試驗

2.2.1 試驗組 先用少量無菌pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液潤濕濾膜，取規定量的供試品，按薄膜過濾法過濾，采用不沖洗、每膜100mL、每膜200mL的無菌pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液沖洗后，在最后一次的沖洗液中加入1ml（小于100cfu/ml）的試驗菌，過濾，分別加硫乙醇酸鹽流體培養基100ml和胰酪大豆胨液體培養基100ml至濾筒內，按規定條件進行培養，逐日觀察。結果見表1。

2.2.2 陽性對照組 另取濾膜，先用少量無菌pH7.0氯化鈉一蛋白胨緩沖液潤濕濾膜，分別加硫乙醇酸鹽流體培養基100ml和胰酪大豆胨液體培養基100ml和1ml（小于100cfu/ml）的6種試驗菌至濾筒內，作為陽性對照，按規定條件進行培養，逐日觀察。結果見表。

2.2.3 陰性對照組 先用少量無菌pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液潤濕濾膜，不加供試液，不加試驗菌，取與供試品等量的無菌pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液，分別置2個濾筒內過濾，分別加硫乙醇酸鹽流體培養基100ml和胰酪大豆胨液體培養基100ml至濾筒內，作為稀釋劑和溶劑的對照，按規定條件進行培養，逐日觀察。結果見表。

2.3 結果

從表1試驗結果表明，呋塞米注射液和異煙肼注射液均存在抑菌性，不能直接進行薄膜過濾法檢查，需要采用稀釋劑沖洗的方法，pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液沖洗1次（100ml/膜）就可以消除這兩種注射液的抑菌性。

根據以上驗證試驗方法，按照2015年版四部藥典“1101 無菌檢查法”依法進行操作，分別對2種注射液4批樣品進行了無菌檢查的方法驗證，結果表明4批樣品的陽性對照在規定時間和條件下均生長良好，陰性試驗組與供試品均澄清無渾濁，結果符合規定。

3.討論

為了選擇合適的試驗方法，本實驗對2種注射液按薄膜過濾法，進行不沖洗、每膜100mL、每膜200 mL進行沖洗的方法，結果表明不沖洗的2種注射液均存在輕微的抑菌性，需要進行稀釋劑沖洗來消除其抑菌性，結果，2種注射液每膜100ml、200ml沖洗管在規定條件和時間內菌落生長良好，表明這2種注射液可以采用以每膜100ml沖洗液進行沖洗，以消除其抑菌性。

先確定了供試品的抑菌性及消除方法后，分別對每種注射液用6種對照菌進行檢查，從而確定每一種注射液的敏感菌株，結果6種對照菌實驗組的與對照組生長情況基本一致，無明顯差異。按參考文獻[3]規定，無抑菌作用及抗革蘭陽性菌為主的供試品，以金黃色葡萄球菌為對照菌。

為考察試驗方法的適用性，保證試驗的準確無誤，分別對本單位第二季度的基本藥物呋塞米注射液和異煙肼注射液進行了無菌檢查的驗證試驗，結果均符合規定，表明試驗的方法是可行的，可以用于上述2種注射液的無菌檢查。

【參考文獻】

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：四部[S].北京：中國醫藥科技出版社,2015：362-382.

[2]中國藥品生物制品檢定所.中國藥品檢驗標準操作規范[M].中國醫藥科技出版社，2010：313-323.

[3]方玲芬.鹽酸左氧氟沙星氯化鈉注射液無菌檢查法方法學研究[J].中國藥事，2006，20(9)：554356.

[4]渝瓊，嵇揚，高錦，等.復方茵陳注射液無菌檢查方法驗證實驗[J].解放軍藥學學報，2008，24(5)：468-469.

[5]渝瓊，嵇揚，高錦，等.維生素取氯化鈉注射液無菌檢查方法驗證實驗[J].解放軍藥學學報，2008，24(6)：563-564.