吡格列酮對大鼠腦出血后炎癥因子的影響

韓寧　吳丹紅　黎佳思　丁素菊　鄧本強　畢曉瑩

腦出血是一種致死、致殘率較高的疾病，目前認為炎癥、自由基以及細胞凋亡是造成腦損傷的重要環節[1-2]。吡格列酮(pioglitazone，Pio)屬于噻唑烷二酮類藥物，通過激活過氧化小體增殖劑激活型受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPAR γ)改善胰島素抵抗，控制血糖水平，臨床上被廣泛應用于治療2型糖尿病[3]。有研究發現，PPARr激動劑可通過抑制組織炎癥反應起到神經保護作用[4-6]，但其對于腦出血所致腦損傷的影響及相關機制未見報道。本研究采用2次注血/退針法制備大鼠腦出血模型，觀察吡格列酮對大鼠腦出血后腦組織炎癥反應的影響，探討吡格列酮在大鼠腦出血性損傷中的保護作用及可能機制。

1　材料及方法

1.1器材與試劑

吡格列酮(sigma公司)；腫瘤壞死因子α(tumornecrosisfactor，TNF-α)抗體、肌動蛋白(β-actin)抗體(美國Cell Signaling公司)、TNF-α ELISA試劑盒(晶美生物工程有限公司)；石蠟切片機(Leica RM2235)；LeicaHI1220水平干式烘干儀；立體定位儀(上海軟隆科技發展有限公司)；OLYMPUS熒光顯微鏡；Image Pro Expess分析系統、酶標儀(Bio-TEK公司synergy HT型，美國)。

1.2實驗動物

健康SD雄性大鼠72只，體重250～300 g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供提供(實驗動物使用許可證號2007-0005)，實驗大鼠自由攝取飲水，常規條件飼養。

1.3大鼠模型的制備和分組

大鼠術前8 h禁食，不禁水；60只大鼠參照Deinsberger[7]、周中和等[8]的報道方法采用2次注血/退針法，即緩慢注射自體血100 μL至基底節制成大鼠ICH模型。大鼠模型成功標準：參照Bederson等[9]的方法,即神經功能缺損評分≥2分。以大鼠腦切片中有明顯血腫存在為模型制備成功。

將60例造模成功的大鼠隨機分為5組，每組各12只。持續吡格列酮組：造模前6h給予胃灌注吡格列酮，造模后維持原劑量；術前吡格列酮組：造模前6 h給予胃灌注吡格列酮，造模后停用；術后吡格列酮組：造模前不給藥，造模后給予胃灌注吡格列酮；模型組：造模前后均不給予吡格列酮灌注；假手術組：同一部位進針注血，不給予吡格列酮灌注。另外選取12例未造模的正常大鼠作為正常組。吡格列酮胃灌注15 mg·kg-1·d-1，1次·d-1，持續3 d。

1.4行為學評定

大鼠參照Ohlsson[10]、Garcia[11]和De Ryck[12]等描述的神經行為學評分方法。神經行為學評分于術后72 h處死大鼠前由1名非手術人員盲法進行。評分標準(總分14分，分數越低癥狀越重)為(1)平衡木試驗：將大鼠放在一根長84 cm，寬2.4 cm的木條上，看其能否早過去。0分為掉下來；1分為未掉下來，但不能走；2分為在行走時掉下來；3分為能走過去，但患側后肢不起作用；4分為能走過去，超過50%的步子打滑；5分為能走過去，偶爾打滑；6分為順利走過；(2)提尾行走試驗：輕提大鼠尾巴末端，使后肢離地行走。0分為無法行走；1分為左前肢稍有伸展，行走時向左打轉；2分為左前肢較右前肢伸展少，稍向左傾行走；3分為雙前肢對稱伸展，沿直線協調行走；(3)四肢協調運動試驗：輕提大鼠尾巴末端，使其懸空觀察四肢的協調運動。0分為左前肢不移動；1分為左側肢體很少伸展；2分為左側肢體較右側伸展少或慢；3分為四肢協調伸展；(4)四肢放置試驗：該試驗由De Ryck等[12]加以簡化和改良。0分為不能正確放置左側肢體；1分為不能完全正確或者放置肢體動作緩慢(>2 s)；2分為迅速準確的放置。

1.5PPARγ蛋白表達水平測定

每組隨機取6只大鼠在腦出血模型建立成功后72 h處死，立即取全腦，用冰生理鹽水漂洗，除去血液，濾紙拭干，稱取部分腦組織重量，用勻漿器勻漿后放入離心管中，加入100 uL RIPA裂解液，至細胞完全裂解；使用BCA蛋白定量法測定PPARγ蛋白表達水平。蛋白質變性后放置100 g/L SDS-PAGE柱上進行電泳分析；電泳后轉移至經甲醇活化的PVDF膜上，并在5%脂肪粉溶液中室溫孵育1 h以封閉膜上的非特異結合；棄去封閉液后膜中加入PPARγ抗體、β-actin抗體，4 ℃搖晃過夜，PBST洗膜3次，每次5 min；加入HRP標記的二級抗體以結合一級抗體及HRP標記的抗生物素抗體以結合分子量標準，室溫孵育膜1 h；TBS/T洗膜3次，每次5 min；將膜置于pierce化學發光試劑盒中2種試劑等比例混合為反應液中室溫孵育1 min，去除過量的溶液，將膜夾在兩塑料薄膜之間，以X光膠片曝光對膜進行掃描分析，其表達水平為目標蛋白與內參蛋白灰度值之比。

1.6TNF-α蛋白、NF-κB蛋白表達水平測定

各組剩余6只大鼠于造模成功后72 h用水合氯醛麻醉后開胸經左心室插管至主動脈，依次灌注生理鹽水100 mL，4 ℃ 4%多聚甲醛250mL，斷頭去腦，于4%多聚甲醛固定24 h，然后使用酒精脫水，二甲苯透明、浸蠟、包埋。

用免疫組織化學染色法進行TNF-α蛋白、NF-κB蛋白表達陽性細胞測定。組織切片脫蠟、水化后用磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Saline，PBS)洗2～3次，每次5 min；3%過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)(80%甲醇)滴加在腫瘤組織芯片(tissue microarray，TMA)上，室溫靜置10 min；PBS洗2～3次，每次5 min；進行抗原熱修復后PBS洗2～3次，每次5 min；滴加正常山羊血清封閉液，室溫20 min，甩去多余液體；滴加TNF-α兔抗鼠多克隆抗體和NF-κB兔抗鼠多克隆抗體50 μL，室溫靜置1 h；4 ℃過夜后在37 ℃復溫45 min；PBS洗3次，每次5 min；滴加Ⅱ抗40～50 μL，室溫靜置，或37 ℃1 h；PBS洗3次各5 min；DAB顯色5～10 min，在顯微鏡下掌握染色程度；PBS或自來水沖洗10 min；蘇木精復染2 min，鹽酸酒精分化；自來水沖洗10～15 min；脫水、透明、封片、鏡檢。

染色成功后每個標本取2張切片，在200倍光鏡下隨機觀察并取血腫周邊5個不重復視野，顯微圖像分析系統采集圖像，分析陽性細胞積分光密度，取平均值，單位為積分光密度/每個200倍視野。

1.7血漿TNF-α表達水平測定

各組隨機取6只大鼠在造模成功后72 h深度麻醉后打開胸腔，下腔靜脈取血2 mL，注入加有抗凝劑的試管中，4 ℃條件下3000 r/min，離心15 min后取上清液；用酶聯免疫吸附法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay ，ELISA)測定血漿中TNF-α的表達水平。

1.8統計學處理

2　結　果

2.1吡格列酮對大鼠腦出血后行為學評分的影響

6組行為學評分有顯著差異(F=12.767，P<0.001)；持續吡格列酮組行為學評分顯著高于術前吡格列酮組、術后吡格列酮組、模型組，顯著低于假手術和正常組(t=2.410、3.879、5.423、9.001、9.101，P=0.037、0.007、0.000、0.000、0.000)；術前吡格列酮組、術后吡格列酮組行為學評分顯著高于模型組，顯著低于假手術和正常組(t1=2.614、10.527、10.608，P1=0.026、0.000、0.000；t2=2.247、13.863、13.992,P2=0.049、0.000、0.000)，術前吡格列酮組、術后吡格列酮組行為學評分無明顯差異(t=0.613，P=0.554)；模型組行為學評分顯著低于假手術組和正常組(t=15.404、15.520，P均=0.000)(表1)。

表1　吡格列酮對大鼠腦出血后行為學評分的影響,分)

注：與持續吡格列酮組比較，*P<0.05；與術前吡格列酮組比較，△P<0.05；與術后吡格列酮組比較，▲P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

2.2吡格列酮對大鼠腦出血后腦組織NF-κB和TNF-α蛋白表達水平的影響

6組TNF-α、NF-κB表達水平有顯著差異(F=11.24，8.91，P均=0.00)；持續吡格列酮組TNF-α表達水平顯著低于術前吡格列酮組、模型組，顯著高于假手術組、正常組(t=2.707、11.233、4.048、4.647，P=0.022、0.000、0.001、0.001)；持續吡格列酮組NF-κB表達水平顯著低于術前吡格列酮組、術后吡格列酮組、模型組，顯著高于假手術組、正常組(t=8.951、3.053、25.855、5.728、9.848，P=0.000、0.012、0.000、0.000、0.000)。術前吡格列酮組TNF-α、NF-κB表達水平顯著低于模型組，顯著高于術后吡格列酮組、假手術組、正常組(t1=2.424、4.702、5.910、5.689，P1=0.036、0.001、0.000、0.000；t2=7.259、6.778、11.530、13.627，P2=0.000、0.000、0.000、0.000)；術后吡格列酮組TNF-α、NF-κB表達水平顯著低于模型組，顯著高于假手術組、正常組(t1=12.650、7.844、6.976，P1均=0.000；t2=22.183、7.873、11.781，P2均=0.000)；模型組TNF-α、NF-κB表達水平顯著高于假手術組、正常組(t1=18.930，17.831，P1均=0.000；t2=22.723、26.489，P2均=0.000)。假手術組和正常組TNF-α無明顯差異(t=0.270，P=0.792)，但假手術組NF-κB蛋白表達水平顯著高于正常組(t=3.134，P=0.011)。(表2，圖1～2)。

表2　吡格列酮對大鼠腦出血后腦組織NF-κB、 TNF-α蛋白表達水平的影響,%)

注：與持續吡格列酮組比較，*P<0.05；與術前吡格列酮組比較，△P<0.05；與術后吡格列酮組比較，▲P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與假手術組比較，▽P<0.05

2.3吡格列酮對腦出血大鼠血漿中TNF-α表達水平的影響

6組大鼠血漿TNF-α表達水平有顯著差異[(0.702±0.013)vs(0.765±0.016)vs(0.787±0.011)vs(0.960±0.028)vs(0.656±0.004)vs(0.643±0.002)ng/dL](F=9.875，P<0.001)，其中模型組最高，而正常組最低。持續吡格列酮組TNF-α表達水平顯著低于術前吡格列酮組、術后吡格列酮組、模型組(t=7.486、12.226、20.471，P均=0.000)，與術前吡格列酮組、術后吡格列酮組TNF-α表達水平顯著高于模型組，顯著低于假手術組、正常組(t1=14.811、16.189、18.533，P1均=0.000；t2=14.086、27.415、31.545，P2均=0.000)，但術前吡格列酮組、術后吡格列酮組TNF-α表達水平無顯著差異(t=2.775，P=0.020)；假手術組TNF-α表達水平顯著高于正常組(t=7.120，P=0.000)。

圖1　大鼠腦出血后72h腦組織NF?κB免疫組化染色(×200倍)　箭頭所示棕色細胞為NF?κB陽性細胞；A為持續吡格列酮組，顯示NF?κB陽性細胞明顯少于B、C、D；B為術前吡格列酮組，陽性細胞少于D，但明顯多于其余圖；C為術后吡格列酮組；D為模型組；E為假手術組；F為正常組，NF?κB陽性細胞最少

圖2　大鼠腦出血后72h腦組織TNF?α免疫組化染色(×200倍)　A為持續吡格列酮組；B為術前吡格列酮組；C為術后吡格列酮組；D為模型組；E為假手術組；F為正常組

3　討　論

腦出血后炎癥反應、自由基生成、脂質過氧化等多種病理機制導致腦損傷區周圍甚至更廣泛的腦神經元繼發性死亡是引起出血性腦損傷的的重要原因之一[1-2]。

PPARs涉及多種能量代謝及細胞活性物質的調節，其合成配體噻唑烷二酮類藥物吡格列酮除改善胰島素抵抗外，還具有一定抗炎、抗氧化作用[13-15]。國外研究發現，PPARγ激活劑可抑制單核細胞表達白介素-6(interleukin- 6，IL-6)和白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)，并可抑制巨噬細胞表達一氧化氮合酶、基質金屬蛋白酶-9(matrix metalloprotease-9, MMP-9)和A型清道夫受體，其機制也可能與拮抗NF-κB活性有關[16-17]。Li等[18]的研究顯示，在動脈粥樣硬化的小鼠模型中格列酮類藥物降低了主動脈根部TNF-α和明膠酶B的表達水平。同時張俊峰等[19]發現PPARγ激活劑可以顯著抑制人巨噬細胞源泡沫細胞IL-6、TNF-α的分泌，抑制MMP-9的分泌和活性，其機制可能與NF-κB通路有關。

NF-κB信號通路參與炎癥反應和細胞凋亡等重要的病理生理過程。已有研究證實腦出血早期即有NF-κB表達，參與腦出血周圍組織繼發性損傷及腦水腫形成[20]；劉兵榮等[21]也發現NF-κB與腦出血后腦水腫有關。目前研究認為NF-κB的激活可能是腦出血后神經細胞凋亡的一個重要原因[22]。本研究發現胃灌注吡格列酮能降低NF-κB 的表達水平，且持續吡格列酮組NF-κB表達水平顯著低于術前吡格列酮組、術后吡格列酮組，術前吡格列酮組NF-κB表達水平顯著高于術后吡格列酮組(P<0.05)，可見持續給藥能夠增強NF-κB表達，減少對神經細胞的損傷，抑制炎性因子釋放；但術前吡格列酮組NF-κB表達水平較高，可能與造模后腦出血大鼠炎性因子維持高水平，而造模后未用藥有關。

TNF-α是前炎性細胞因子，主要由激活的單核巨噬細胞產生，是腦出血后引起周圍腦組織水腫形成的重要因素之一[23]。TNF-α可直接作用于血管內皮細胞，引起腦組織多核白細胞聚集和激活，釋放炎性介質，誘導粘附因子、白介素等合成和釋放，進一步加重腦損傷[24]。本研究發現，PPARγ激活劑吡格列酮可有效降低大鼠腦出血72 h血漿和腦組織中TNF-α表達水平，從而減輕全身及腦組織中的炎癥反應，并促進了大鼠神經功能的恢復。臨床研究發現，腦出血患者腦組織內TNF-α處于高表達水平，直接參與到腦出血損傷中。本研究持續吡格列酮組血漿和腦組織TNF-α表達水平均最低，其中術前吡格列酮組TNF-α表達水平顯著高于術后吡格列酮組，但2組血漿TNF-α表達水平無明顯差異，故本研究推測吡格列酮能夠下降TNF-α的釋放能力，負性調節腦組織中的TNF-α表達水平，但造模后腦組織和血清中TNF-α表達水平均明顯上升，僅術前給藥可能無法達到預期的治療效果。

綜上所述，吡格列酮作為PPARγ激活劑，能降低NF-κB 的表達水平，并抑制TNF-α的表達，促進了大鼠神經功能的恢復，發揮腦出血后的腦保護作用。但本研究僅就PPARγ激活劑吡格列酮對于大鼠炎癥相關因子NF-κB、TNF-α表達水平的影響進行了探討，相關通路及機制尚需要進一步研究。

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