基于SRAP分子標記的23株大球蓋菇遺傳多樣性和親緣關系分析

朱靜嫻 李麗君 趙淑芳 陳宸 姜淑霞

摘要：利用相關序列擴增多態性（sequence-related amplified polymorphism，SRAP）分子標記對國內外不同來源的23株大球蓋菇菌株進行遺傳多樣性和親緣關系分析，從288對引物中篩選出穩定性好、可重復性高、多態性穩定并能擴增出清晰明亮條帶的38對引物。通過SRAP擴增圖譜分析得出，以基因組DNA為模板的23株菌株擴增片段分子量在100～2 000 bp間，共擴增出322個位點，其中有205個多態性位點，多態位點比率為63.66%；供試菌株間的遺傳相似系數為0.6646～0.9658；采用UPGMA法對擴增圖譜進行聚類分析，在相似水平0.84時可將23株菌株分為3個類群，第Ⅰ類群為來自國外的2株菌株；第Ⅱ類群為本實驗室馴化篩選的3株耐高溫品種，第Ⅲ類群為國內不同地市的18株菌株。結果表明，不同大球蓋菇菌株間存在明顯遺傳多樣性，SRAP分子標記技術可將23株供試菌株鑒別開，且能分析出不同菌株間的親緣關系。本研究可為大球蓋菇菌株親緣關系的鑒定及新品種選育提供理論依據。

關鍵詞：大球蓋菇；SRAP分子標記；遺傳多樣性；親緣關系

中圖分類號：S646.1+90.24文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2018）03-0022-07

Abstract Sequence-related amplified polymorphism （SRAP） molecular marker technique was used to study the genetic diversity and phylogenetic relationship among 23 Stropharia rugosoannulata strains collected from home and abroad. A total of 288 pairs of SRAP primers were tested， and 38 pairs could produce high-quality PCR production with good stability， repeatability and polymorphism. The analysis of SRAP amplification pattern showed that 322 bands were amplified from genomic DNA of 23 strains with the size of 100～2 000 bp， of which 205 bands were polymorphic and the percentage of polymorphic sites was 63.66%. The genetic similarity coefficient among the tested strains was ranged from 0.6646～0.9658. The cluster analysis proceeded by UPGMA method showed that 23 strains could be divided into three major groups at the similarity coefficient of 0.84. Group Ⅰ included two strains from abroad； Group Ⅱ included three high temperature resistant strains domesticated by our laboratory； Group Ⅲ were 18 strains cultivated or preserved in different cities in China. The results showed that significant genetic diversity existed among the strains. SRAP molecular marker technique could identify 23 strains clearly and analyze the phylogenetic relationship among different strains. This test provides the theoretical basis for the identification of Stropharia rugosoannulata phylogenetic relationship and new strain breeding.

Keywords Stropharia rugosoannulata； SRAP molecular marker； Genetic diversity； Phylogenetic relationship

大球蓋菇（Stropharia rugosoannulata Farl. ex Murrill）別名皺環球蓋菇、皺球蓋菇、酒紅球蓋菇，屬于擔子菌門，層菌綱，傘菌目，球蓋菇科，球蓋菇屬[1]。大球蓋菇是優良的食、藥用菌，其菇體大、色艷、質脆清香、營養豐富，有預防冠心病、助消化、緩解精神疲勞等多種保健價值，是國際菇類交易市場上的十大菇種之一，也是聯合國糧農組織（FAO）向發展中國家推薦栽培的食用菌之一[2]。野生大球蓋菇于20世紀初在美國首次發現，并于1969年在德國人工馴化栽培成功，隨后波蘭、捷克斯洛伐克、匈牙利等國家相繼引種栽培。我國大球蓋菇野生資源主要分布于云南、西藏、四川、山西、新疆、遼寧、吉林等地[3]。20世紀80年代，上海市農業科學院食用菌研究所從波蘭引進該菌種并在國內首次試栽成功，進而福建省三明真菌研究所對其栽培研究取得良好效益[4]。近年來，大球蓋菇在福建、浙江、陜西、河北、遼寧、山東多省以各種栽培模式迅速發展，栽培前景十分廣闊。

SRAP分子標記是一種基于PCR的新型標記系統，目前廣泛應用于植物物種的遺傳多樣性和親緣關系分析，相對于其他分子標記方法，SRAP分子標記在植物物種的遺傳多樣性和親緣關系分析中能獲得更多的信息[5-9]。該標記具有簡便、穩定、高重復率、便于克隆目標片段的特點，并已被應用于圖譜構建性狀的標記和遺傳多樣性分析[10]。SRAP標記技術已在木耳、金針菇、靈芝、雞腿菇、香菇、蘑菇屬等食用菌上得到應用[11-16]。本研究采用SRAP分子標記，對收集到的國內外23株大球蓋菇進行遺傳多樣性分析，明確其菌株間的親緣關系，以期為大球蓋菇菌株資源的保護和下一步育種工作提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

本試驗所用的23株大球蓋菇菌株均由山東省農業微生物重點實驗室提供。具體菌株編號、名稱、來源及產地見表1。

1.2 供試培養基

PDA培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1 000 mL，pH值6.5。

1.3 耐高溫大球蓋菇菌株的獲得及供試菌絲體制備

1.3.1 耐高溫菌株的獲得 將活化好的22株備選菌株（表2）置于25℃條件下培養5 d后轉移至全自動培養箱中，程序設置為34℃和25℃交替循環，34℃持續8 h，25℃16 h，連續處理14個循環。剔除其中生長緩慢、畸形的菌株，將剩余菌株轉接到新培養皿上，25℃培養5 d后，將程序設置為38℃ 6 h和25℃18 h，連續處理14個循環。再剔除表現不好的菌株，將程序設置為42℃ 4 h和25℃ 20 h，連續處理14個循環。選取其中生長速度較快、菌絲潔白粗壯的菌株作為耐高溫備選株并通過繼代培養進行耐高溫穩定性驗證。驗證方法為：將篩選獲得的耐高溫備選株連續培養20代，分別取5、10、15、20代置于42℃條件下培養4 h，觀察菌絲生長情況，獲得耐高溫性穩定的菌株作為耐高溫菌株。

1.3.2 大球蓋菇菌絲體制備 將23株大球蓋菇菌株在PDA平板培養基上培養7～10 d后，轉接到鋪有玻璃紙的新鮮PDA平板培養基上，25℃恒溫培養10 d后，分別刮取200 mg新鮮菌絲備用。

1.4 23株大球蓋菇DNA提取、擴增和電泳檢測

取200 mg新鮮菌絲放入研缽，倒入液氮迅速研磨成粉末，用植物基因組DNA提取試劑盒提取DNA，經1.0%的瓊脂糖凝膠電泳后，在凝膠成像分析系統中拍照。以標準DNA分子量作對照，用紫外吸收法檢測DNA濃度并稀釋成50 ng/μL，貯存于-20℃冰箱中備用。

SRAP擴增反應體系：反應體積25 μL，其中2×Tap PCR Master Mix 12.5 μL，100 μmo1/L上、下游引物各1 μL，模板為50 ng/μL DNA 1 μL，用ddH2O補足體積。

SRAP擴增基準程序：94℃預變性5 min；94℃變性1 min，35℃復性1 min，72℃延伸1 min，5個循環；94℃變性1 min，50℃復性1 min，72℃延伸1 min，35個循環；72℃延伸10 min，4℃保存。

取擴增產物7 μL進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，同時以DL 2000 DNA Marker作為分子量標準，100 V恒壓電泳40～60 min，通過紫外凝膠成像系統觀察并拍照。

1.5 SRAP引物及反應條件篩選

采用Li等[17]2001年發表的引物，由鉑尚生物技術（上海）有限公司合成（表3）。正向引物16條，反向引物18條，采用Me-Em的組合表示方式共得到288對引物。選用3株大球蓋菇DNA對288對引物進行初步篩選，將重復性好、強度較高、清晰可辨無爭議、能體現菌株間差異的條帶確認為標記條帶，進行相應的統計和分析以篩選出最佳組合引物。

SRAP-PCR反應體系退火溫度的優化：選用編號為1、5和14菌株的DNA作為模板，用2對引物（Me5、Em4和Me7、Em9）進行擴增，對退火溫度進行篩選，溫度設置為32、32.1、32.4、32.8、33.2、33.7、34.2、34.7、35.2℃、35.6、35.9、36℃。溫度確定后另選3株大球蓋菇DNA模板對SRAP-PCR體系進行驗證。

1.6 SRAP電泳結果統計及處理分析

將相同引物 PCR 擴增產物中電泳遷移率一致的標記條帶確認為同一條帶，擴增陽性記錄為“ 1”，擴增陰性記錄為“ 0”，把圖形資料轉換成數據資料，統計形成“ 0/1”表型數據矩陣，根據該數據矩陣統計算出多態性位點數、擴增位點數和多態位點比率 P（Percentage of polymorphic sites），估算遺傳分化的水平。

計算公式：P=k/n×100%。

式中P為多態位點比率，k為多態性位點數，n為擴增位點數。

利用POPGENE 1.32軟件計算各菌株間的Neis遺傳相似系數（GS）、遺傳距離（GD）、Neis遺傳多樣性指數（H）和Shannon信息指數（I），并利用NTSYS-PC軟件進行菌株間的非加權組平均法（UPGMA）聚類分析，生成遺傳距離聚類圖。

2 結果與分析

2.1 SRAP引物篩選及其擴增結果分析

288對引物中共篩選出38對重復性好、多態性比率高的引物。利用38對引物對23株大球蓋菇基因組DNA進行SRAP擴增并電泳檢測，共擴增出322個位點，其條帶分子量大小在100～2 000 bp之間。其中多態性位點205個，多態位點比率為63.66%。38對引物擴增的位點數從4～12個不等，平均每對引物擴增出8.47個位點，平均多態性位點數為5.39個（表4）。引物Me5-Em1對23株大球蓋菇菌株的SRAP圖譜見圖1。

基于23株供試菌株的SRAP擴增多態性，利用POPGENE 1.32軟件對試驗數據進行各項參數的統計分析。結果表明，樣品間的平均Neis遺傳多樣性指數為0.1616，平均Shannon指數為0.2577，說明供試菌株間的遺傳多樣性較高，遺傳差異性較大。

2.2 聚類分析

由圖2可以看出23株大球蓋菇菌株兩兩間的相似性系數范圍為0.6646～0.9658。菌株編號6與7的相似性系數為0.9658，親緣關系最近，菌株編號2與19的相似性系數為0.6646，親緣關系最遠。

從圖3可以看出，23株供試菌株均可以鑒別開。當遺傳相似系數為0.84時，23株大球蓋菇供試菌株被分為3個類群：第Ⅰ類群為來源于國外的編號為1號和2號的菌株；第Ⅱ類群為本實驗室耐高溫馴化后篩選的3株菌株（菌株編號為18、19和20）；第Ⅲ類為來自國內13個不同地市的18株菌株。其中，第Ⅱ類群的3株菌株之間的親緣關系與其原發菌株（菌株編號為15、16和17）之間的親緣關系相似，即原發菌株16和17聚在一支，與15較遠，耐高溫菌株中的19和20同樣聚在一起，與18較遠；第Ⅲ類群中，源自云南子實體顏色為黃色的菌株（菌株編號為21、22、23）聚在一起，來自山東濟寧的4株菌株（菌株編號為14、15、16、17）聚在一起；黑龍江（菌株編號為9、13）、遼寧（菌株編號為5、8、10）、山東濟南（菌株編號為6）、山東臨沂（菌株編號為4）、山東泰安（菌株編號為7）的菌株與三明真菌研究所保存的菌種（菌株編號為11）遺傳距離較近。

結果表明：（1）本試驗中多個地理位置相距較近的菌株聚在一進化支上，說明供試菌株間的遺傳相似性與它們的地理位置有一定的相關性；部分地理位置與氣候條件相差較大的栽培菌株也有聚在一個進化支上，說明多個大球蓋菇品種有互相交流或引種異地栽培狀況。（2）3株耐高溫菌株間的相似性系數較高，與馴化前的3株原發菌株有一定的差異，說明長期在高溫條件下培養的菌株，為了適應高溫環境，部分基因發生了相應變異。但從它們的遺傳相似性與其他菌株相比較仍然較高，其親緣關系明顯近于其他菌株，說明SRAP分子標記技術能高效鑒別大球蓋菇菌株。（3）黃色菌株之間親緣關系較近，雖然同樣聚在第Ⅲ類群但是與國內其他菌株親緣關系較遠，說明表型顏色不同的品種在基因上也有一定差異。

為進一步明確大球蓋菇菌株遺傳多樣性與其地理來源的關系，將20株（菌株編號為18、19、20除外）大球蓋菇按照其地理來源分為8個群體。采用POPGENE 1.32軟件計算不同地理來源的大球蓋菇群體間遺傳相似性系數Neis和遺傳距離（表5）。由表5可以看出：8個群體的遺傳相似性系數為0.7422～0.9584，其中遼寧群體和黑龍江群體相似性系數最高，為0.9584，說明其親緣關系最近。而四川和大阪兩個群體間的相似性系數最小為0.7422，可能由其地理位置相隔較遠，生境差別較大，對基因交流產生了一定的障礙，因而相似性系數較小。根據群體間遺傳相似性系數，運用POPGENE軟件進行聚類（圖4）。由圖4可以看出遼寧地區和黑龍江地區的菌株親緣關系最近，其次為山東地區，這些居群間的地理位置接近，氣候條件類似，在長期自然選擇條件下，基因保持著較小的遺傳距離。

3 討論與結論

SRAP技術現目前廣泛應用于食用菌的菌株分子鑒定、分類學研究、遺傳多樣性及親緣關系分析等方面。許曉燕等[18]應用SRAP和AFLP標記對19株毛木耳進行了遺傳多樣性分析；Sun等[19]采用SRAP標記對31個靈芝商業栽培品種和野生菌種進行了分類學及遺傳多樣性研究；盧政輝等[20]通過SRAP技術對不同地區的24個秀珍菇進行了DNA指紋分析，獲得了它們的親緣關系；蔡志欣等[21]利用SRAP技術對32個茯苓菌株進行了DNA指紋分析，找出了各菌株間的親緣關系，分析得到供試菌株間的遺傳背景，這均為食用菌遺傳學研究和育種提供了依據。

由于從菌絲及子實體形態上區分不同大球蓋菇品種比較困難，本研究通過SRAP技術成功對23株大球蓋菇菌株進行鑒別，菌株間聚類分析結果表明，在不同遺傳相似系數水平上，供試菌株可分為多個亞群；不同亞群表明菌株間親緣關系與地理來源、耐高溫馴化和不同的表型有關，體現了大球蓋菇種內遺傳多樣性豐富；國內20株供試菌株被全部區分開，表明該技術可用于大球蓋菇不同菌株的遺傳背景分析，適用于親緣關系鑒定。本研究選用的供試大球蓋菇菌株包含國家認證品種、國內大部分主要栽培品種、黃色變異菌株以及耐高溫菌株，反映出菌株間親緣關系的整體情況，同時為品種分類鑒定和遺傳育種的親本選擇提供了理論依據。

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