幾種常用的氨基酸分析技術研究進展

馬 璐,雷 祿,黃雪秋,凌紹明

(1.百色學院 預科教育學院，廣西 百色 533000； 2.百色學院 化學與環境工程學院，廣西 百色 533000)

氨基酸是重要的生命物質，分子結構中既含有羧基又含有氨基，是蛋白質的基本組成單元，也是肌酸、肽類激素、神經遞質等含氮類物質的原料來源。氨基酸在自然界中的存在形式既有游離態又有結合態。氨基酸分析在生物、醫學、食品等領域都有重要的意義。本文對目前用于氨基酸分析的幾種常用方法進行綜述。

1 高效液相色譜法

高效液相色譜法(HPLC)靈敏度高、分析快、適用性強，在定性定量檢測得到廣泛的應用。氨基酸分析方法主要采用反相HPLC，反相HPLC常以C18鍵合硅膠為固定相。由于大多數氨基酸缺乏具有強紫外吸收或有熒光效應的官能團，需要借助衍生試劑將氨基酸轉化成能被靈敏檢測的衍生物。目前氨基酸檢測多以柱前衍生反相高效液相色譜法為主。

孫言春等[1]以6-氨基喹啉-N-羥基琥珀酰亞胺基氨基甲酸酯(AQC)為柱前衍生試劑，采用BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)分離柱，以乙腈 ( 含0.15% (v/v ) 甲酸及30 mmol/L 乙酸銨) 和30 mmol/L乙酸銨水溶液為流動相，流速為0.7 mL/min，光電二極管陣列檢測史氏鱘 、達氏鰉和小體鱘卵中17種氨基酸的含量。熊少祥等[2]采用3-對羧基苯甲酰喹啉-2-甲醛(CBQCA)將一級氨基酸衍生為具有強熒光信號的7-氮雜-1-氰基苯并異吲哚，建立了分離檢測鼠腦微透析液中氨基酸的反相HPLC新方法，該研究采用自組裝的高效液相色譜-激光誘導熒光-增強型電荷耦合器件檢測器裝置，比常規的熒光檢測器具有更優異的性能。白文莉等[3]采用反相HPLC梯度洗脫分離，異硫氰酸苯酯(PITC)為柱前衍生劑，以正纈氨酸為內標，紫外檢測器測定馬破傷風免疫球蛋白F (ab＇)2中甘氨酸的含量。

近年來，液相色譜串聯質譜(LC-MS/MS)技術發展迅速，質譜能提取和確證特征性離子，具有較高的選擇性和靈敏度，且一般無需對樣品進行衍生化處理，簡便、快捷，該技術在氨基酸分析中有重要的應用。

Dietzen等[4]建立了LC-MS/MS法檢測血漿、血清和尿液中的氨基酸，30種氨基酸在20 min內達到基線分離，并將該方法與陽離子交換法進行對比，結果表明該方法耗時更少，選擇性更佳。鄧其馨等[5]建立LC-MS/MS法對煙草中的游離氨基酸進行定量分析，18種氨基酸在20 min內得到很好的分離和測定，線性相關系數均大于0.9990，檢出限為0.5×10-4～0.1 mol/L，加標平均回收率為90.0%～106.0%。該方法簡單、重現性好，靈敏度高，滿足分析要求，適合煙草中游離氨基酸的檢測。鄭重等[6]用甲醇為樣品的提取試劑，無需衍生步驟，利用LC-MS/MS直接檢測敖東植物酵素中16種氨基酸的含量。線性相關系數均大于0.99，樣品回收率為86%～110%。郭華等[7]以鄰苯二甲醛衍生珍珠粉酸解液，采用LC-MS/MS技術同時分析珍珠粉中的7種氨基酸，7種氨基酸在0.1～100 μg/mL范圍內呈現良好的線性關系，相關系數在0.9928～0.9990范圍內，檢出限在0.03～15 ng/mL之間，回收率為95%～105%。

隨著分析技術的不斷提高，在HPLC的基礎上又開發出了檢測性能更優異的分析儀器-超高效液相色譜(UPLC)，UPLC比普通HPLC具有更好的分離度和更高的靈敏度，極大地縮短了分析的時間，使得UPLC-MS/MS方法在氨基酸分析領域表現出更為廣闊的應用前景。

Armenta等[8]建立了一種快速、重現性好、靈敏的UPLC-MS/MS法分析了惡性瘧原蟲和人體紅細胞中氨基酸的含量。Helmond等[9]使用酰胺型固定相，建立UPLC-MS/MS法用于檢測指紋樣品中的氨基酸，樣品無需衍生，可直接檢測。黃鑫等[10]建立了檢測大鼠海馬和大腦皮層中生物胺類及氨基酸類神經物質的UPLC-三重四極桿質譜法，不需要對樣品進行衍生化和固相萃取等復雜處理，10 min內即可完成樣品中17 種神經化學物質的分離及確證，該方法檢測時間短、靈敏度高、專屬性強、穩定性良好。李好麗等[11]為了分析烤煙中氨基酸含量與烤煙香型、產地的關系，以AQC為柱前衍生試劑，建立了UPLC-單重四極桿質譜法同時測定烤煙中20種游離氨基酸的分析方法。王星等[12]采用PITC為衍生化試劑，建立了一種快速、靈敏、準確的UPLC-MS/MS方法解析中藥材天南星中20個成分，其中包括2個胺類化合物和18個氨基酸，為中藥材中氨基酸類極性非紫外活性成分的分析方法的建立提供依據。

2 氣相色譜

氣相色譜是在氨基酸分析領域有較早應用歷史的分析技術，由于氨基酸沸點較高，在測定前需將氨基酸衍生化為易汽化的衍生物。氣相色譜具有快速、簡便、靈敏、易于與質譜聯用等優點，不足之處在于衍生化過程易產生干擾物。

Persson等[13]將氨基酸進行叔丁基二甲基硅烷化，并用13C、15N標記方法，采用氣相色譜串聯質譜(GC-MS/MS)對植物中的氨基酸進行定量分析。張紅漫等[14]先用鹽酸水解沙苑子樣品，再對其水解液進行酯化和酰化處理，采用GC-MS/MS共鑒定出15種氨基酸，其中7種為人體必需氨基酸，再由外標法對每種氨基酸進行了定量分析，結果表明沙苑子中氨基酸的總質量分數為4.32 %。侯捷等[15]建立了固相萃取-硅烷化衍生-氣相色譜質譜法聯用分析精氨酸發酵液中的15種氨基酸，并計算15N標記精氨酸發酵液中的氨基酸同位素豐度。楊芹等[16]用甲基叔丁基醚-甲醇-水體系提取蝎子樣品后，對提取液上層有機相物質進行甲酯化處理，對下層水相進行硅烷化處理，再經氣相-質譜聯用分析，研究發現在有機相中檢測到 30 種脂肪酸，在水相中檢測到氨基酸類、糖類及有機酸類等化合物，其中檢測到的氨基酸有18種。黃志等[17]以N-叔丁基二甲基甲硅烷基-N-甲基三氟乙酰胺為衍生化試劑，對萃取過的煙葉樣品進行硅烷化衍生，再利用GC-MS/MS測定煙草中18種游離氨基酸，結果表明18種氨基酸的加標回收率為97.4%～114.1%，RSD在0.17%～3.4%范圍內，該方法快速、靈敏、準確，可用于煙草中氨基酸含量分析。

3 毛細管電泳

毛細管電泳(CE)是以高壓直流電場為推動力，毛細管為分離通道建立起來的分離技術,不僅具有樣品用量少、分離效率高、分析速度快、成本較低等優點，且還能分離手性氨基酸。氨基酸樣品經毛細管電泳儀分離后，能被相應的檢測器識別，實現氨基酸的定性和定量分析。

Qi等[18]建立了手性配體電泳法對丹酰基氨基酸進行手性分離和檢測，該方法成功分離了17對氨基酸對映體，還能用于測定米醋中氨基酸的含量。Lorenzo等[19]建立了一種以4-氟-7-硝基苯并-2-氧雜-1,3-二唑為衍生試劑的毛細管電泳-激光誘導熒光法成功測定了16份不同尿液樣品中7種氨基酸的含量。胡月芳等[20]建立了毛細管電泳-電化學檢測(CE-ED)法測定淮山中8種必需氨基酸含量。先用乙醇處理淮山樣品，再用鄰苯二甲醛對樣品進行衍生處理，采用CE-ED測定，8種氨基酸在12 min內達到了基線分離，檢出限為0.01～0.05 μg/L。周賢婧等[21]基于樣品注入后背景吸收添加劑吸光度的減小，建立了毛細管電泳-間接紫外檢測法用于檢測蜂蜜中 9 種游離氨基酸，蜂蜜無需衍生，經陽離子交換樹脂除去糖類物質后直接進樣分析，9 種氨基酸于11 min 內實現了分離，檢出限最低達到0.3 mg /L，該方法已成功應用于不同蜜源植物和產地的蜂蜜的測定。任挺鈞等[22]建立了毛細管電泳-電容耦合非接觸電導檢測法同時分析運動員營養補劑中的支鏈氨基酸(亮氨酸、纈氨酸和異亮氨酸)，3種氨基酸在以乙酸為背景電解質下，在20 min內得到了基線分離，該方法避免了樣品衍生化處理，操作簡便、靈敏度較高。

4 離子交換色譜

陽離子交換色譜法是基于氨基酸在酸性條件下變成陽離子并經陽離子交換色譜柱分離后，再與茚三酮發生衍生化反應，產生能被紫外-可見光檢測器檢測的紫色或深藍色或黃色衍生物。以此為原理，科學家研發出了能使氨基酸分析實現自動化的氨基酸分析儀，氨基酸分析儀極大縮短分析的時間。該方法具有分析快速、重現性好、自動化程度高、準確度高、能檢測多數氨基酸等優點，但存在儀器造價高、靈敏度不高且需雙波長檢測等不足。

馮志強等[23]建立采用全自動氨基酸分析儀測定醬油中氨基酸的含量的方法，結果表明釀造醬油和配制醬油中氨基酸的種類及含量存在一定的差異，分析結果為釀造醬油和配制醬油的鑒別提供了一定的依據。苗雨田等[24]將黃酒經氮氣吹干復溶后、過膜,采用全自動氨基酸分析儀對黃酒中的游離氨基酸進行測定，方法檢出限最低可達到0.01 mg/100 mL,回收率為90.1%～101.2%,該方法具有可靠、快速、重現性好等優點，適用于大量樣品的分析。黃永連等[25]利用鹽酸水解藻類后，采用氨基酸自動分析儀分析不同藻類樣品中氨基酸的組成及含量。

陰離子交換色譜-積分脈沖安培(HPIC-IPAD)法是一種最近發展起來的氨基酸檢測方法，具有快速、準確、靈敏、選擇性高等特點，且無需對樣品進行柱前或柱后衍生處理，能對氨基酸進行直接分析。

李國強等[26]建立分析人血漿中16種游離氨基酸的HPIC-IPAD法，檢出限為0.11～3.3 μg/L,樣品回收率為 87%～117%，該方法操作簡單，樣品無需衍生。Rombouts等[27]建立了簡便、準確的HPIC-IPAD測定小麥蛋白、麥膠蛋白、麥谷蛋白中的氨基酸，樣品經鹽酸水解后直接分析，無需衍生化或氧化處理。吳伶俐等[28]以AminoPac PAl0 為氨基酸分析柱，水、250 mmol/L NaOH和1 mol/L NaAc 為流動相，采用HPIC-IPAD法對榴蓮中的17種氨基酸進行定性和定量分析，方法檢出限為0.0028～0.0136 μmol/L，樣品加標回收率在80.0%～112.9%之間，為榴蓮的食用和藥用價值的深入研究提供了參考。于宏曉等[29]采用AminoPac PA10陰離子交換柱，用HPIC-IPAD法測定煙草中18種氨基酸的含量，最低檢出限為0.03～0.75 μg/mL，利用該方法還對比了3種不同類型單料煙和國內外不同卷煙中游離氨基酸的含量。

5 小結

氨基酸分析已成為食品、生命、醫藥等眾多領域的重要內容，其分析方法的研究與改進也受到越來越多的關注。在衍生方法、柱載體化學和自動化技術發展的驅動下，涌現出一系列氨基酸分析技術，但這些分析方法各有其優缺點。HPLC是氨基酸分析常用的方法，但易受衍生技術的限制。HPLC與能提取特征性離子的MS聯用，一般無需衍生處理可直接檢測氨基酸，在氨基酸檢測領域有重要應用。UPLC-MS/MS不僅分析效率比常規HPLC高，且還能對氨基酸樣品進行直接測定。GC雖與MS聯用，但該技術會受到衍生副產物的干擾。氨基酸分析儀自動化程度高，但儀器多為國外進口品牌，在成本上受到一定的限制。CE技術在手性氨基酸分析中有重要應用。HPIC-IPAD能直接檢測氨基酸，避免樣品衍生步驟，有望成為氨基酸分析方法改進和完善的新方向。經過不斷改進和完善，前處理簡單、分析速度更快、選擇性好、準確度高的氨基酸分析技術將會不斷涌現，為氨基酸分析領域打開新局面。