巨噬細胞葉酸受體β表達對博萊霉素誘導小鼠肺纖維化的影響*

姚梓平，秦慧娟，何春輝

(新疆醫科大學第一附屬醫院中醫內科，烏魯木齊 830054)

特發性肺纖維化(IPF)是特發性間質性肺炎的常見形式，該病的病理學特點表現為肺泡上皮損傷和增生、炎性細胞浸潤、成纖維細胞增生、細胞外基質沉積和瘢痕形成[1]。我國IPF患者人數為50萬左右，患病人數還在持續增加。該病的治療效果不好，預后差，5年生存率只有30%～50%。目前IPF的發病機制尚不明確。巨噬細胞浸潤與多種類型的肺纖維化(PF)有關[2]。巨噬細胞能夠產生趨化因子CCL2和CCL12，巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)和纖維化的轉化生長因子(TGF-β1)，間質巨噬細胞產生的促炎癥或促纖維化細胞因子在IPF患者的肺中升高[3]，說明巨噬細胞在IPF的發病機制中可能起到一定的作用。在動物實驗中，博萊霉素常用于誘導肺損傷和纖維化來模擬研究IPF[4]。葉酸受體(FR)歸為糖基磷脂酰肌醇錨定糖蛋白家族，其對葉酸和5-甲基四氫葉酸具有高親和力，由于FRα在癌細胞中的高表達和FRβ在活化的巨噬細胞中的高表達，葉酸受體靶向藥物常應用于癌癥和自身免疫疾病的診斷和治療[5]。

為了研究巨噬細胞中FRβ的表達在IPF發病中的作用機制，檢測了其在常規特發性肺纖維化(UIP)患者和博萊霉素誘導PF的小鼠中肺組織內的分布，并且求證減少巨噬細胞中FRβ表達是否可以抑制博萊霉素誘導小鼠的肺纖維化，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1患者肺組織標本與實驗動物 UIP患者的肺組織從新疆醫科大學第一附屬醫院的7例UIP患者的肺部中獲得，UIP患者的診斷參照美國胸科學會關于IPF標準診斷[6]。對照的肺組織從5例肺癌的切除手術中獲得。所有患者均簽署知情同意書，此項研究也獲得本院倫理委員會的批準。選取18只健康雄性C57BL/6小鼠，6～8周齡，平均(19.32±2.30)g，購于新疆醫科大學動物實驗中心(動物合格證號編號：XJYKDX-20160317001)。

1.2主要試劑與儀器 博萊霉素(Nihon Kayaku Co，日本)，小鼠抗人FRβ單克隆抗體(mAb)(Serotec，英國)，大鼠抗小鼠FRβmAb(克隆5)(Serotec，英國),抗原修復液(博士德生物，中國)，小鼠抗人CD68mAb(Dako Japan Co.Kyo，日本)，大鼠抗小鼠CD68mAb(Serotec，英國)，兔抗小鼠TGF-β1抗體(Santa Cruz Biotechnology，美國)，山羊抗小鼠CCL2抗體(Santa Cruz Biotechnology，美國)，山羊抗小鼠CCL12抗體(Santa Cruz Biotechnology，美國)，山羊抗小鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)抗體(R&D Systems，美國)，dsFv抗FRβ-PE38(免疫毒素)(博士德生物，中國)，VH-PE38(博士德生物，中國)，MAX-PO二抗(博士德生物，中國)，NovaRED試劑盒(Santa Cruz Biotechnology，美國)。CCD照相機(Nikon，日本)，計算機輔助圖像分析儀(Nikon，日本)。

1.3方法 將小鼠分為正常組、對照組和實驗組，每組各6只，小鼠中的PF誘導參考GHARAEE-KERMANI等[7]的實驗方法,使用異氟烷對6～8周齡的雄性C57BL/6J小鼠進行麻醉，然后將100 mL溶于鹽水中的博來霉素(4 U/kg)滴入小鼠的氣管。博來霉素滴注第3天，經鼻給予小鼠dsFv抗FRβ-PE38(免疫毒素)(實驗組)或VH-PE38(對照蛋白)(對照組)。每只小鼠每隔1 d給予濃度為0.1 mg/mL的免疫毒素或對照蛋白30 μL，直到博來霉素滴注后第19天，并持續監測21 d。在第21天，依然存活的小鼠被處死。正常組的小鼠不做任何處理。小鼠的左肺用于組織學分析，右肺用于羥脯氨酸分析。所有動物程序均符合本院動物實驗倫理準則，并經本院委員會批準。

1.3.1肺部纖維化評分 將小鼠左肺進行冰凍，切片，冷丙酮固定處理，然后依循Masson三色法步驟染色。每只小鼠制備至少4個切片，每個切片中隨機選擇20個區域，遵循盲法原則，由經驗豐富的病理學家閱片評定。根據Ashcroft法對肺纖維化程度進行評分[8]。

1.3.2肺部羥脯氨酸分析 將小鼠右肺經空氣干燥、稱重后，在110 ℃條件下，將其置于6 mol/L的HCl溶液中進行酸水解，時間為16 h。將水解產物懸浮在等量的6 mol/L NaOH中，然后過濾，測定羥脯氨酸的濃度。

1.3.3免疫組化染色 經過甲醛固定、石蠟包埋、脫蠟及再水化過程，制備得到人肺組織切片(5 μm)。根據廠家的說明書，使用區分自然感染動物和接種免疫動物(DIVA)的試劑對抗原進行修復。在用3%脫脂乳和10%正常山羊血清封閉抗原后，再利用鼠抗人CD68單抗，或鼠抗人FRβ單抗，或同型匹配但并不相關的單抗對切片進行免疫染色。然后用MAX-PO二抗和NovaRED試劑盒進一步染色處理。使用0.3% H2O2消除內源性過氧化物酶活性。最后經數字視像CCD照相機拍攝和計算機輔助圖像分析儀分析后，獲得圖像。

利用鼠抗CD68、鼠抗FRβ、抗TGF-β1、抗TNF-α、CCL2、CCL12或同型匹配的無關抗體，對經博來霉素滴注處理或未處理小鼠的肺組織所制備的丙酮冰凍切片進行染色。然后速行雙色免疫組化染色。切片用一代mAb染色后，繼而用NovaRED顯色。將切片置入0.1 mol/L的Gly-HCl緩沖液孵育1 min后，以此洗脫一抗，然后使用TBST(20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.4，0.15 mol/L NaCl，0.1% Tween-20)洗滌。隨后，依次先將切片與另一原代mAb孵育1 h，然后與生物素化的二抗(Nichirei)孵育30 min，最后與堿性磷酸酶綴合的鏈霉親和素(Nichirei)孵育。二抗染色后利用Vector Blue顯色處理。每塊肺組織選取4個切片，應用計算機輔助圖像分析儀對每個切片進行半定量分析。每個切片隨機選定10個區域進行觀察分析。通過取樣界定免疫染色的顏色閾值，以此檢測區分紅色和藍色，并將該閾值應用于所有的樣本。

1.4統計學處理 繪制Kaplan-Meier曲線，并進行廣義Wilcoxon檢驗，以此評估生存率的顯著性。方差分析(ANOVA)用于檢驗組間其他數據的差異。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1巨噬細胞中FRβ表達在UPF患者和博來霉素誘導PF小鼠肺組織中的分布 檢測UPF患者肺組織內的巨噬細胞時，發現其相對正常肺組織有更多能夠表達FRβ的間質巨噬細胞(圖1)。博來霉素氣管內滴注后3 d的小鼠肺部可見表達FRβ的肺泡巨噬細胞和間質巨噬細胞，而在14 d后兩種細胞數量達到頂峰(圖2)。在博來霉素滴注后的每個觀測時間點，都可以看到巨噬細胞中FRβ表達主要集中于肺的纖維化病灶處。

A：正常肺組織表達CD68巨噬細胞;B：UIP患者肺組織表達CD68巨噬細胞;C:正常肺組織表達FRβ的巨噬細胞;D:UIP患者肺組織表達FRβ的巨噬細胞

圖1巨噬細胞中FRβ表達在UPF患者肺部的分布情況(×200)

2.2TGF-β1在巨噬細胞FRβ表達中的表達 采用博萊霉素滴注后第7天的小鼠肺部切片來檢測巨噬細胞中FRβ表達是否會釋放TGF-β1，發現大多數巨噬細胞中FRβ表達都屬于表達CD68的巨噬細胞，許多巨噬細胞中表達CD68或FRβ的同時也能表達TGF-β1，TGF-β1的表達比例在巨噬細胞的FRβ表達中顯著高于CD68的巨噬細胞表達(圖3)。TGF-β1表達多聚集于博來霉素誘導形成PF的小鼠肺組織的巨噬細胞的FRβ表達中。

圖2博來霉素誘導PF小鼠肺部巨噬細胞中FRβ表達隨時間的變化(×200)

2.3免疫毒素作用于 FRβ時對博來霉素誘導形成PF病理過程的干預 滴注博來霉素的第3天到第19天，通過小鼠鼻內途徑給予免疫毒素，與給予蛋白的對照組相比，實驗組的免疫毒素能明顯增加小鼠的存活率(P=0.003)(圖4)，同時也能降低小鼠肺組織的纖維化程度(P=0.014)；實驗組肺組織巨噬細胞的FRβ表達也減少(P=0.000)，實驗組肺組織羥脯氨酸的整體水平顯著低于對照組(P=0.009)(圖5)。在第21天，與給予蛋白的對照組相比免疫毒素能降低博萊霉素誘導的PF小鼠肺部TNF-α，趨化因子CCL2和CCL12細胞的數量(均P=0.000)(圖6、7)。

a:P<0.05，與對照組相比

圖4免疫毒素對博來霉素誘導PF小鼠的存活率的影響

A:免疫毒素對博來霉素誘導PF小鼠的纖維化程度的影響;B：免疫毒素對博來霉素誘導PF小鼠巨噬細胞的FRβ表達影響(相對表達量)；C：免疫毒素對博來霉素誘導PF小鼠羥脯氨酸水平的影響；a:P<0.05，與對照組相比

圖5免疫毒素對博來霉素誘導PF小鼠的纖維化程度、巨噬細胞的FRβ表達及羥脯氨酸水平的影響

A:TNF-α的細胞數量;B：趨化因子CCL2的細胞數量；C：趨化因子CCL12的細胞數量；a:P<0.05，與對照組相比

圖7免疫毒素對博萊霉素誘導的PF小鼠肺部TNF-α、趨化因子CCL2和CCL12細胞數量的影響(相對表達量)

3 討 論

本研究中發現，與正常肺組織相比，UIP患者的肺組織中可以觀察到大量能表達FRβ的間質巨噬細胞和肺泡巨噬細胞。正常組織的巨噬細胞中FRβ表達很有限，巨噬細胞的FRβ表達主要存在于博來霉素誘導形成PF的纖維化病灶中。隨著PF的進展，博來霉素誘導小鼠肺組織中巨噬細胞的FRβ表達數目逐漸增加。表達FRβ的巨噬細胞在PF肺部中首次出現，小鼠經鼻內滴注免疫毒素，能夠減少肺內羥脯氨酸的含量以及減輕肺纖維化的程度，從而增加了博來霉素誘導實驗鼠的存活率。

由巨噬細胞釋放的TGF-β1被認為可作用于局部的成纖維細胞[9]。本研究中發現，在博來霉素誘導形成PF的早期，巨噬細胞的FRβ表達會釋放TGF-β1，這表明這些細胞可能直接參與小鼠PF的發病過程。在第14天用免疫毒素也未能提高PF小鼠的存活率，這可能與其他細胞產生TGF-β1相關。研究結果表明，表達FRβ的巨噬細胞產生的TGF-β1可能主要作用于博來霉素誘導PF發病過程的初始階段。

由巨噬細胞和上皮細胞產生的CCL2、CCL12和CCL3趨化因子已確定為促纖維化介質[10]。CCR2(CCL2和CCL12的受體)或CCR5(CCL3的受體)的缺乏能抑制纖維化的發展[11]。白細胞介素(IL)-13已被證明有助于PF的發展，其可能通過誘導CCL2、CCL3而實現[12-13]。本研究發現，經鼻給予免疫毒素可減少促纖維化細胞因子TNF-α、CCL2和CCL12的細胞數量，降低博來霉素誘導PF中巨噬細胞的FRβ表達，可減少由炎癥巨噬細胞所釋放的各種促纖維化細胞因子。因此，靶向消除巨噬細胞的FRβ表達將比靶向消除個體巨噬細胞所釋放的促纖維化細胞因子更有效。

有研究表明，使用抗CD11b 或抗CD11a的mAb能夠對博來霉素誘導小鼠形成的PF起到抑制作用[14]。然而，這些治療可能會抑制先天免疫，因為CD11a、CD11b位于單核細胞和駐留型巨噬細胞。有研究表明，使用CD11b的單克隆抗體治療，會加重大腸桿菌肺炎小鼠的病情[15]。與表達CD11b或 CD11a的細胞相反，正常組織的巨噬細胞中FRβ表達是很有限的。因此，通過FRβ靶向清除炎癥巨噬細胞對于治療IPF患者是非常理想的治療辦法，同時該治療方式也不會影響單核細胞和駐留型巨噬細胞的正常功能。隨著免疫核糖核酸酶(immuneRNase)的發現，且其中的毒素部分和免疫球蛋白片段分別被人類核糖核酸酶和人源化免疫球蛋白替代后[16]，作用于FRβ的免疫毒素的毒性和免疫原性這一缺陷也將被克服。一旦免疫RNA酶中的RNase部分被內化，其將發揮RNA降解活性，從而導致靶細胞的死亡。由于正常組織不表達或低水平表達葉酸受體，而大多數葉酸受體對FRα比對FRβ具有更高的結合親和力，因此也可使用葉酸拮抗劑[17]。IPF具有異質性特征，其表現為在正常表觀的肺部中交替出現外周纖維化、間質炎癥和蜂窩狀態改變的區域。這些炎癥成分主要由巨噬細胞、淋巴細胞、漿細胞、嗜中性粒細胞和嗜酸性粒細胞組成[18]。在診斷IPF時，若不行肺部穿刺活檢，則很難確定激活的巨噬細胞的分布。由于放射性葉酸靶向藥物與葉酸受體結合其主要集中于激活的巨噬細胞[19]。因此通過FolateScan對表達FR細胞的圖像化[20]，將有助于預測最佳治療時機和監測靶向治療巨噬細胞的FRβ表達對IPF患者的療效。

綜上所述，人和PF實驗動物肺部的炎性巨噬細胞均可表達FRβ。選擇性降低巨噬細胞的FRβ表達能顯著抑制博來霉素誘導PF的病理過程，因此也意味著靶向治療表達FRβ的巨噬細胞可能會為IPF的治療帶來希望。

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