毛絨制品的快速分子鑒定方法

劉曉俠,尤忠毓,王玉潔,孫世元

我國是毛絨制品生產、加工、出口大國,毛絨類纖維的總加工量居世界第一[1]。羊絨作為重要的毛絨類產品之一,其細度均勻,手感滑糯柔軟而細膩,拉力強而富有彈性,質感、手感、保暖性等明顯優于其他毛絨制品,素有“軟黃金”之稱[2-3]。一些不法生產廠商為達到降低成本提高利潤的目的,在加工羊絨制品過程中往往摻入價值相對較低的其他纖維,如綿羊絨、改性綿羊毛、拉細綿羊毛和羊駝絨等,這些摻假行為不僅損害了消費者的利益,更影響了我國毛絨產業的健康可持續發展。

毛絨類纖維現有的鑒別方法,主要是根據GB/T 16988-2013《特種動物纖維與綿羊毛混合物含量的測定》的規定,使用投影顯微鏡對山羊絨[4]、兔毛、羊駝毛等絨毛類型的各組分纖維含量的測定。該鑒別方法過分依賴于檢測人員的工作經驗,而對羊絨、改性綿羊毛和羊駝絨等形態結構極其相似的纖維,這種方法顯現出其局限性,已不能滿足毛絨產業發展的要求。近年來發展起來的圖像識別法[5]、紅外光譜法[6]、實時定量PCR法[7]、基因探針法[8-9]、靶向蛋白質組技術[10]和生物芯片法[11]等雖各有千秋,卻均因各種原因難以推廣。

隨著各種毛絨混紡織物的大量出口,毛絨類纖維的成分鑒定工作已成為維護商家與消費者權益,增加我國國際市場競爭力以及打擊假冒劣偽產品的重要一環,也一直是紡織檢測行業具有挑戰性的課題之一,已成為業界亟待解決的問題。

本研究旨在利用基因擴增技術,對毛絨制品實現快速準確地定性鑒定。

1 試驗部分

1.1 材料和儀器

標準參考材料:從內蒙古收集來的純羊絨,以及上海第一紡織有限公司生產的細羊毛、羊駝絨。一般沒有市售的參考纖維混合物,纖維混紡是由兩種或三種不同的參考材料(羊絨/羊毛/羊駝)定量混合制備(表1和表2),這些參考混合物通過顯微鏡檢查進行了分析。

試劑:Bio miga試劑盒;儀器:PCR擴增儀(5331型,Ger many),冷凍干燥器(6870 SPEX Sa mplePrep Freezer/Mill?,USA)。

1.2 毛絨制品線粒體DNA的提取與擴增

研究和開發動物纖維的DNA檢測,關鍵技術難點在于DNA的提取[3,12]。特別是經過染色、整理等加工處理的毛絨制品,更難獲得高質量的可用于進一步分析的DNA片段,而PCR技術只需微量的DNA樣品,就能很好地解決上述問題,因此基于線粒體DNA片段的PCR技術是一種理想的選擇。

纖維在冷凍干燥器用液氮研磨加工成細小的顆粒。研磨時注意以下條件:先預冷5 min,然后以10次/s的速率運行,1 min內運行2個循環,再冷卻1 min。選用Bio miga試劑盒,按說明書步驟稍作改進,將粉碎的毛絨制品進行蛋白酶、DTT預處理→高效裂解→柱分離→獲取線粒體DNA等步驟,分別提取羊絨、羊毛,羊駝的線粒體 DNA,并以此為模板進行PCR特異性擴增。PCR反應條件為:95℃預變性5 min,95℃變性30 s,35℃復性45 s,72℃延伸30 min,經過30個循環后,最后72℃延伸10 min。

表1 試驗用毛絨織物

表2 試驗用混紡毛絨織物

2 結果與討論

2.1 引物的設計

從Genbank中分別搜索山羊、綿毛和羊駝的Cytb基因,利用Vector NIT軟件中align程序進行序列比對,利用比對的非同源性序列設計特異性引物,并確保擴增的羊毛、羊絨及羊駝絨的Cytb基因片段長度不同,設計引物見表3。

表3 不同來源的Cytb基因片段的引物序列

Cytb基因是編碼線粒體內膜細胞色素b氧化酶基因的一個亞基,參與氧化磷酸化合成ATP過程。Cytb基因核苷酸序列總長為1 140 bp,編碼379個氨基酸。Cytb基因進化速度適中,易用一些通用引物對所檢測的物種進行擴增測序,較小的一段基因片段包括了科間、屬間、種間乃至種內的遺傳信息,適合于分析種間或者屬間的差異被認為是解決系統分類和進化問題最可信的遺傳標記之一[13],已被廣泛應用到動物的分子鑒定、系統發育分析和起源與進化的研究中。

利用以上引物序列分別對山羊、綿羊及羊駝的線粒體基因組進行擴增,根據擴增產物的大小不同,可分別鑒別出羊絨、羊毛和羊駝絨。

2.2 羊毛、羊絨及羊駝絨的定性

從理論上分析,如果樣品中僅存在羊絨、羊毛或羊駝纖維,那么用相應的引物可以擴增出目的條帶,但用其他引物則無擴增結果。

分別采用羊毛、羊絨及羊駝引物進行擴增相應的毛絨,擴增結果見圖1至圖3。

圖1 羊絨樣品的的擴增結果

圖2 羊毛樣品的的擴增結果

圖3 羊駝絨樣品的擴增結果

從圖1、圖2和圖3可知,分別利用羊毛、羊絨和羊駝的Cytb基因片段設計的特異性引物,使不同來源的Cytb基因片段均得到特異性擴增。

2.3 羊絨/羊毛混合物的DNA檢測靈敏度

當樣品中羊絨、羊毛及羊駝絨纖維的含量分別為0.5%、1%、5%、10%、20%。利用相應的Cyt b引物進行特異性擴增,結果見圖4。

圖4 Cyt b基因片段的擴增結果

由圖4可知,當混合樣品中羊絨比例、羊毛比例或羊駝絨的比例≥0.5%時,利用設計的特異性引物,PCR擴增技術均能準確定性。

2.4 羊絨、羊毛、羊駝混合物定性

理論上分析,如果樣品中同時存在羊絨、羊毛和羊駝絨纖維,利用設計的特異性引物,可以同時擴展出三條長度不同的條帶,只有當羊絨、羊毛或羊駝絨的含量很低時才有可能導致相應條帶的不顯著。

將羊絨,羊毛和羊駝絨纖維按不同比例混合(見表2),采用表3中的引物,進行PCR擴增實驗,結果見圖5。

圖5 不同來源的Cytb基因片段的擴增結果

從圖5中可以看出,混合樣品中同時檢測多種成分時,羊絨含量僅為0.5%時,就有相應的擴增條帶,當混和樣品中羊駝絨的含量≥5%時,有相應的擴增條帶。

3 結論

(1)基于不同生物Cytb基因非同源性序列設計特異性引物,進行PCR擴增定性鑒別羊絨、羊毛和羊駝絨,只要某一毛絨的含量≥0.5%,就可利用DNA技術定性鑒別出羊絨、羊毛或羊駝絨組分的存在。

(2)對于羊絨、羊毛和羊駝絨的混合物,當羊絨含量≥0.5%,羊駝絨含量≥5% 時,PCR擴增技術定性可同時鑒別羊絨、羊毛及羊駝絨纖維,避免了人為因素的影響,檢測準確性、靈敏度極高,對解決貿易糾紛,尤其是國際性貿易爭端可以發揮重要作用。

(3)分別針對羊絨、羊毛及羊駝絨纖維Cytb基因設計特異性引物的擴增技術,有效提高了羊絨檢測的靈敏度,為PCR技術在毛絨制品方面的推廣應用奠定了基礎,同時為基于PCR技術的羊絨、羊毛及羊駝絨纖維定性檢測研究提供了有力的技術保障。

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