二代測序技術在Cardio-facio-cutaneous綜合征診斷中的應用研究*

肖 海，張照婧，呂 雪，李 濤，郭謙楠，侯巧芳，王紅丹，劉紅彥，霍曉東，廖世秀△

(1．河南省人民醫院醫學遺傳研究所，鄭州 450003；2．鄭州大學基礎醫學院醫學遺傳與細胞生物學系，鄭州 450003；3．河南省人民醫院健康管理科，鄭州 450003)

Cardio-facio-cutaneous綜合征(CFC)與Costello綜合征(CS)、Noonan綜合征(NS)一起被歸類為RAS心肌病群[1-2]。該病群的臨床表型有很多相似之處，患者均可表現出不同程度的智力發育異常、心臟發育異常及身材矮小等臨床癥狀。雖然該病群疾病也有各自相對特異性的表征，但是僅僅憑借表型進行診斷還是十分困難。本文利用比較基因組雜交技術(aCGH)結合二代測序技術(NGS)對1例疑似NS患者進行檢測，并結合臨床表型診斷為CFC，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 患兒，女，1歲11月，漢族，因生長發育遲緩就診于河南省人民醫院醫學遺傳研究所。患兒系G1P1，孕27周超聲提示永久性右臍靜脈，羊水過多，羊水最大深度82 cm，羊水指數319 mm。足月順產。出生后偶有抽搐發作，1月時磁共振(MRI)腦部平掃未見明顯異常。患兒運動發育滯后，1歲時頭部CT結果提示：(1)考慮復合腦積水征象；(2)左頂部頭皮下血腫。1歲11月時心臟超聲檢查提示：(1)左房稍大；(2)左室壁彌漫性增厚；(3)左室流出道流速稍增快；(4)左室舒張功能減低。患兒眼距稍寬，鼻梁塌平，外側眼角偏下，頭發稀疏，父母非近親結婚，否認遺傳病家族史，見圖1。本研究經醫院倫理委員會批準，患者及家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1DNA提取 簽署知情同意書后，分別抽取患兒及其父母外周血各2 mL，EDTA抗凝。采用DNA提取試劑盒(Dneasy Tissue Kit DNA，德國Qiagen公司)提取外周血DNA，采用Nandrop 2000分光光度計(美國Thermo公司)進行DNA定量檢測。

1.2.2aCGH檢測分析 應用Human genome CGH Microarray 8X60K芯片(美國Agilent公司)對患兒進行檢測，采用Microarray Scanner(美國Agilent公司)及其他配套軟件對芯片進行掃描和初步分析，檢索UCSC、DECIPHER、ISCA等數據庫對檢測出的缺失、重復進行比對及致病性鑒定。

1.2.3NGS高通量測序 根據參考文獻[3]，取3 μg患者的DNA構建測序文庫。用Nanodrop 2000分光光度計對文庫標本進行定量檢測。文庫經PCR擴增后，應用心肌病相關基因檢測試劑盒(北京邁基諾基因科技公司)進行檢測，Illumina HiSeq2000 基因分析系統(美國Illumina公司)上機測序。

圖1 患兒面部圖

1.2.4Sanger測序 按照Sanger法檢測患兒及其父母的BRAF基因c.1406位點。GenBank上查找BRAF基因序列，用NCBI上的在線軟件Primer-BLAST設計引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成，上游引物5′-TTG GGA GAT TCC TGA TGG GC-3′，下游引物5′-TTG GAG GAG TCC TGA AAC TAA TCA-3′。PCR體系為25.0 μL，其中DNA模版1.0 μL，上下游引物各0.5 μL，2X Taq DNA mix 12.5 μL，ddH2O 10.5 μL。PCR條件:95 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火35 s，72 ℃延伸50 s，循環35次；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。所有標本的PCR產物經純化后利用ABI3130基因分析儀進行測序。測序結果與NCBI上的標準序列進行BLAST分析。

2 結 果

2.1aCGH檢測情況 患兒染色體未發現拷貝數變化，為一正常女性，見圖2。

圖2 患兒aCGH檢測情況

2.2突變位點檢測 二代測序結果顯示,在chr7-140481402位點即BRAF基因第11外顯子c.1406處存在G>A雜合突變(紅色區域)，見圖3。該突變導致基因編碼的第469位密碼子由甘氨酸變為谷氨酸，即p.G469E。經查閱相關數據庫已有該位點相關致病性報道。

2.3Sanger法測序 利用Sanger法對患兒的NGS結果進行驗證，發現患兒BRAF基因第11外顯子存在c.1406 G>A雜合突變(圖4A)，Sanger法檢測患兒父母的BRAF基因c.1406位點，發現其父母該位點均為G/G野生型(圖4B、4C)。

圖3 患兒突變位點檢測

A：患兒BRAF基因c.1406G>A雜合突變(紅圈處)B：患兒父親BRAF基因c.1406位點為G/G野生型(紅圈處)；C：患兒母親BRAF基因c.1406為G/G野生型(紅圈處)

圖4 BRAF基因c.1406位點反向測序情況

3 討 論

染色體不平衡的拷貝數變異(copy number variants,CNVs)與原因不明的發育遲緩、智力低下、多種體征畸形及自閉癥患者關系密切。2010年，國際細胞基因組芯片標準協作組推薦將aCGH作為這類患者的臨床首選檢測方法[4]。由于臨床診斷不明確，并且患兒存在先天性心臟病、生長發育遲緩、智力障礙等癥狀，為了避免漏檢，筆者先用aCGH技術在全基因組水平對患兒進行檢測，檢測是否存在CNVs。aCGH檢測結果顯示，患兒染色體未發現拷貝數變化，排除CNVs導致的先天性心臟病、生長發育遲緩、智力障礙。

RAS心肌病群中的3種疾病在臨床癥狀上有太多相似之處，本研究中的患兒具有典型的智力發育遲緩、心臟發育異常等，臨床醫生根據癥狀很難做出明確診斷，疑似為NS。雖然3種疾病的表型相似，但是致病的分子機制卻不同，并且RAS心肌病群中的疾病具有遺傳異質性的特點，比如CFC主要是由4種基因突變導致的，分別為BRAF、MAP2K1、MAP2K2和KRAS[5]。如果利用一代測序技術對3種疾病的致病基因外顯子逐一進行檢測，需要的工作量十分巨大。與一代測序不同，NGS憑借其通量大、速度快等優點，在分子生物學研究、疾病的診斷等方面發揮了重要作用，已用于復雜性神經系統疾病、惡性腫瘤、免疫檢測及微生物學研究等領域[6]。因此本研究選擇利用NGS技術同時對3種疾病的致病基因進行檢測。

NGS結果顯示，患兒BRAF基因第11外顯子存在c.1406 G>A雜合突變。該突變為錯義突變，導致該基因編碼的第469位氨基酸由甘氨酸變為谷氨酸，即p.G469E。2006年，NIIHORI等[7]在4例CFC患者中檢查到該突變。利用Sanger法對患兒的NGS結果進行驗證，二者結果一致說明二代測序結果準確可信。甘氨酸為極性不帶電氨基酸，谷氨酸為極性帶負電氨基酸，氨基酸的改變會對基因編碼的蛋白空間結構造成影響，進而影響蛋白的正常功能。BRAF是RAS-RAF-MEK-ERK通路的關鍵調控因子，該通路對細胞的增殖、生長、凋亡十分重要[8]。目前研究顯示，CFC患者中近75%為BRAF基因突變導致的，近25%為MAP2K1基因和MAP2K2基因突變導致的，2%～3%為KRAS基因突變導致[9-10]。利用Sanger法對患兒父母的BRAF基因c.1406位點進行檢測，發現其父母該位點均為野生型，說明患兒為自發突變導致的CFC。

CFC是一種常染色體顯性遺傳病，該病于1986年首次報道[11-12]。目前關于CFC的報道特別少，在全世界范圍的發病率不詳，有文獻報道日本CFC的發病率估計為1/810 000[13]。其常見的臨床表現為先天性心臟病、生長發育遲緩、智力障礙、皮膚異常等[14]。CFC最早的臨床特征為胎兒期超聲提示胎兒頸部透亮度增加，有時為囊狀水瘤，67%可見羊水過多[15]，50%患兒早產。

綜上所述，結合基因檢測結果與臨床資料，本研究患兒排除NS，應為CFC。在對于臨床癥狀相似但致病基因不同的疾病診斷過程中，NGS技術可以起到很好的輔助診斷作用。

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