過表達C3G對高糖誘導H9C2心肌細胞增殖和凋亡的影響*

張 旭，陳旺盛，張夢嬌，聶 嬌，陳 秀△

(西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院:1.老年病科;2.胃腸外科，四川瀘州 646000)

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是指由于持續(xù)高血糖水平所致心臟微血管病變、心肌代謝紊亂及心肌細胞纖維化等病變，導致的心肌結構發(fā)生廣泛改變，最終引起左心室肥厚、心臟泵血功能障礙的一種疾病狀態(tài)[1-3]。多項研究提示，在糖尿病動物模型和糖尿病患者中均存在心肌細胞凋亡增加、生存力降低[4-5]，但其機制目前仍報道甚少。鳥苷酸交換因子C3G參與多種細胞在不同病理條件下的增殖分化與凋亡[6-7]，筆者前期研究發(fā)現C3G在心肌缺血、缺氧損傷模型中對心肌細胞具有保護作用[8]，但其對高糖誘導環(huán)境下心肌細胞的作用目前暫無報道。本研究探討過表達C3G對高糖誘導下H9C2心肌細胞的增殖率、凋亡率的影響，以期為DCM的防治尋找新的思路。

1 材料與方法

1.1實驗材料 大鼠H9C2心肌細胞株購自中科院上海生命科學研究院；DMEM培養(yǎng)基、D-葡萄糖、胎牛血清(FBS) 購自美國 Gibco 公司；pCXN2-Flag、pCXN2-Flag-hC3G質粒由重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院婦產科令狐華教授惠贈；質粒提取試劑盒購自美國Omega Bio-Tek公司；轉染試劑脂質體LTX 和Plus購自美國Invitrogen公司；小鼠抗大鼠β-actin抗體 (sc-47778)、兔抗大鼠及人C3G抗體 (sc-15359) 購自美國Santa Cruz公司；細胞凋亡試劑盒 (Annexin V-FITC、PI) 購自江蘇碧云天生物研究所；四甲基偶氮唑鹽(MTT)購自美國Sigma公司。

1.2方法

1.2.1實驗方法及分組 H9C2心肌細胞在含10% FBS的低糖(5 mmol/L) DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，將處于對數生長期的細胞分別接種于6個直徑10 cm培養(yǎng)皿中，細胞密度達60%左右時分別用空白試劑、空質粒、人過表達C3G質粒瞬時轉染H9C2心肌細胞，將細胞標記為空白組、空載體組、過表達C3G組3組，每組2份，培養(yǎng)9 h后重新消化細胞、細胞計數，從以上3組中分別取相同細胞，接種于6個平板中(Western blot用培養(yǎng)皿，MTT用96孔平板，流式細胞計數用6孔板)，低糖培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h讓其充分貼壁后將其中一份培養(yǎng)基置換為含10% 胎牛血清的5.5 mmol/L的 D-葡萄糖培養(yǎng)基，另一份培養(yǎng)基置換為含10% 胎牛血清的33.3 mmol/L的 D-葡萄糖培養(yǎng)基(此時設置為實驗的0點)，培養(yǎng)72 h(此時設置為實驗的72點)，將細胞分為空白組、空載體組、過表達C3G組、空白+高糖組、空載體+高糖組、過表達C3G+高糖組。

1.2.2Western blot檢測C3G蛋白相對表達水平 分別提取6組細胞總蛋白,BCA法測定蛋白濃度，用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯胺分離凝膠(SDS-PAGE)，每組分別上樣20 μg蛋白，電泳分離后電轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，4%牛奶37 ℃封閉2 h后，一抗孵育8 h以上，洗膜，孵育二抗，洗膜，最后通過 ECL發(fā)光試劑盒顯影成像，進行吸光度值定量分析，實驗重復3次。采用Quantity-One軟件分析各組C3G蛋白的相對表達量，C3G 蛋白相對表達量用C3G吸光度值/β-actin吸光度值表示。

1.2.3MTT法檢測細胞增殖率 分別檢測各組0點、72點細胞的吸光度值，在相應的時間點取相同細胞數加MTT液20 μL (5 mg/mL),4 h后棄液，加200 μL二甲基亞砜(DMSO)，37 ℃搖床培養(yǎng)30 min，酶標儀(570 nm波長)測定吸光度值，實驗重復3次。細胞增殖率(%)= (72點吸光度值-0點吸光度值)/0點吸光度值。

1.2.4流式細胞術檢測細胞凋亡率 分別檢測各組72 點的凋亡率。收集細胞，將其懸浮后加入Annexin V-FITC、PI后進行流式細胞儀檢測細胞凋亡，細胞凋亡率=凋亡細胞數/總細胞數。

2 結 果

2.1各組H9C2心肌細胞C3G蛋白表達 較空白組(0.764±0.223)、空載體組(0.666±0.200)，過表達C3G組(1.233±0.340)的C3G蛋白表達明顯增加(P<0.05)。較空白+高糖組(0.262±0.082)、空載體+高糖組(0.249±0.074)，過表達C3G+高糖組(0.646±0.217)的C3G蛋白表達明顯增加(P<0.05)，見圖1。

A:空白組；B:空載體組；C:過表達C3G組；D:空白+高糖組；E:空載體+高糖組；F:過表達C3G+高糖組

圖1各組H9C2心肌細胞C3G蛋白表達

2.2各組H9C2心肌細胞增殖率 較空白組、空載體組,空白+高糖組、空載體+高糖組的增殖率均明顯降低(P<0.05)；過表達C3G組的增殖率較空白組、空載體組明顯升高(P<0.05)；較空白+高糖組、空載體+高糖組，過表達C3G+高糖組的增殖率顯著升高(P<0.05)，見圖2、表1。

A:空白組；B:空載體組；C:過表達C3G組；D:空白+高糖組；E:空載體+高糖組；F:過表達C3G+高糖組

圖2各組H9C2心肌細胞的增殖率

2.3各組H9C2心肌細胞凋亡率 較空白組、空載體組,空白+高糖組、空載體+高糖組凋亡率明顯升高(P<0.05)；過表達C3G組的凋亡率較空白組、空載體組明顯降低(P<0.05)；較空白+高糖組、空載體+高糖組，過表達C3G+高糖組的凋亡率明顯降低(P<0.05)，見圖3、表1。

A:空白組；B:空載體組；C:過表達C3G組；D:空白+高糖組；E:空載體+高糖組；F:過表達C3G+高糖組

圖3 各組H9C2心肌細胞的凋亡率

3 討 論

心肌細胞的凋亡增加、生存力降低是許多心血管疾病發(fā)病的重要特點之一[9-10]。研究表明，糖尿病患者中心肌細胞的廣泛凋亡、變性與壞死等心肌結構的改變，嚴重降低了心臟在應對各種損傷時的代償能力，導致心臟結構與泵血功能障礙[11-12]。心肌細胞凋亡在DCM發(fā)病過程中起著重要作用，DCM中的心肌細胞更易發(fā)生壞死、凋亡。

整合素信號通路家族，如整合素的β1、β3 亞基及其下游的焦點黏附激酶(FAK)、整合素連接激酶(ILK)等具有促進心肌細胞存活、抑制心肌細胞凋亡的作用。完全敲除FAK可導致小鼠在胚胎期死亡，而主要原因可能與心血管系統(tǒng)發(fā)育缺陷有關，過表達ILK可促進心肌細胞增殖、存活，抑制心肌細胞凋亡，改善心肌梗死后心臟重塑[2,13-15]。C3G作為其重要成員之一，主要參與胚胎發(fā)育、細胞分化、增殖、凋亡等細胞行為，在心肌細胞及神經系統(tǒng)胚胎發(fā)育中起著必不可少的作用[6,16]，然而，在DCM心肌細胞中的作用卻鮮有報道。

本實驗研究發(fā)現，C3G在H9C2心肌細胞中存在表達；過表達C3G可使H9C2心肌細胞中C3G蛋白表達量明顯增加，可明顯降低心肌細胞的凋亡，促進心肌細胞的增殖、存活；經過高糖處理后，心肌細胞出現大量壞死、凋亡，細胞凋亡率明顯升高，細胞增殖率明顯降低，而這種現象經過轉染過表達C3G后得以改善。由此可以證實，過表達C3G可以提高高糖環(huán)境下心肌細胞的生存力，對研究DCM的治療有一定理論意義。

本研究還發(fā)現，在高糖+空白組、高糖+空載體組的C3G蛋白表達較空白組、空載體組明顯減少，說明高糖環(huán)境并不能直接促進心肌細胞自身的C3G蛋白表達；而在過表達C3G+高糖組，其C3G蛋白表達、心肌細胞增殖率、凋亡率較高糖+空白組、高糖+空載體組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其機制可能與轉染后C3G在心肌細胞中的表達明顯增加或者與過表達C3G能夠激活或抑制其心肌細胞的某些信號分子有關，但C3G能夠抑制高糖環(huán)境中的心肌細胞凋亡、促進心肌細胞增殖存活的機制仍不清楚，有待進一步研究。

總之，本研究結果證實，高糖環(huán)境能明顯抑制心肌細胞增殖、促進心肌細胞凋亡。過表達C3G可以提高H9C2心肌細胞的生存力，逆轉高糖環(huán)境對心肌細胞所造成的不良影響。本研究為過表達C3G保護糖尿病引起的心肌損傷提供了理論依據，隨著研究的深入，C3G在糖尿病心肌病中的作用及其相關聯(lián)的信號通路也將進一步被明確。C3G有望成為探索DCM發(fā)病機制的新靶點。

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