miR-107靶向細胞周期蛋白E1對人非小細胞肺癌A549細胞功能的影響研究

劉荷英，王 輝，季洪健，姚秋菊

(上海解放軍第85醫院呼吸內科 200052)

肺癌是對人類健康與生命危害最大的一種惡性腫瘤，也是惡性腫瘤的首位死因，約占惡性腫瘤死因的30%[1]。其中，約80%的肺癌是非小細胞肺癌，盡管手術、放療、化療和靶向治療技術在不斷地提高，但是NSCLC的總體5年生存率仍小于16%[2-3]。微小RNAs(microRNAs,miRNAs)是一類長21～25個核苷酸的具有非編碼功能的小RNA。miRNAs通過降解靶基因mRNA或阻遏其轉錄后翻譯在腫瘤形成和發展中發揮著重要的作用，其可能扮演著原癌基因、抑癌基因、腫瘤轉移侵襲、凋亡和耐藥調節等諸多角色[4]。

近年來對miRNA在肺癌中作用的研究逐漸成為了一個熱點，這對未來肺癌的診斷和治療帶來了廣闊的前景[5-7]。諸多研究表明，miR-107在膠質瘤、乳腺癌、胃癌和肺癌中均表達下調[8-12]。同時研究還指出，過表達miR-107能夠靶向腦源性神經營養因子(BDNF)間接調控PI3K/AKT信號通路，從而抑制非小細胞肺癌細胞的增殖和侵襲[11]。也有研究[12]指出，miR-107通過靶向CDK8增加非小細胞肺癌細胞對化療藥物順鉑的敏感性，但是對于miR-107調控非小細胞肺癌細胞周期的具體機制目前還尚未有文獻詳細報道。

本課題首先在非小細胞肺癌A549細胞株中上調miR-107水平研究其對細胞增殖和周期的影響，然后構建含預測靶基因 3′-非編碼區(3′-untranslated region,3′-UTR)的質粒行雙熒光素酶報告基因實驗檢測miR-107與下游靶基因的結合位點，并用實時定量逆轉錄PCR和Western blot檢測miR-107對靶基因的mRNA和蛋白表達的影響，最后檢測在非小細胞肺癌細胞中沉默靶基因的表達后對A549細胞增殖和周期的影響。本課題初步探討了miR-107在肺癌細胞生長中的可能作用及其機制，為后續基于miRNA的肺癌臨床生物治療的新靶點開發提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1材料 人非小細胞肺癌A549細胞和HEK293T細胞購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心；miR-107模擬物、抑制模擬物和陰性對照模擬物(上海吉瑪公司)；小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)和陰性對照siRNA(上海銳博生物)；DMEM培養基和胎牛血清(美國Gibco公司)；青-鏈霉素(上海吉諾生物科技有限公司)；TRIzol和lipofectamine2000(美國Invitrogen公司)；噻唑藍(MTT)和碘化丙錠(PI,美國Sigma公司)；二甲基亞砜和結晶紫(申能博彩生物技術有限公司)；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(美國Promega公司)；抗體細胞周期蛋白E1(CCNE1)和β-actin(美國Abcam公司)；Synergy2多功能酶標儀(美國BioTek公司)；FCASCalibur 流式細胞儀(美國BD公司)；7900HT熒光定量儀(美國ABI公司)；Odyssey蛋白分析成像系統(美國LICOR公司)。

1.2方法

1.2.1細胞培養和轉染實驗 A549和HEK293T細胞加含10%胎牛血清和1%青-鏈霉素的DMEM培養液，置于37 ℃、CO2體積分數為5%的培養箱中培養。在倒置光學顯微鏡下觀察細胞生長情況，待單層細胞生長達到80%融合時，用0.25%胰蛋白酶消化傳代，取對數生長期的細胞用于后續實驗。將處于對數生長期的A549細胞按每孔3×105接種到6孔板內，培養細胞融合度為40%～50%時進行細胞轉染，轉染步驟參照lipofectamine2000轉染試劑說明書，轉染培養5 h后換成正常培養基。實驗分組：脂質體+miR-107模擬物過表達組(OV-miR-107組)，脂質體+miR-107抑制模擬物下調組(KD-miR-107組)和脂質體+陰性對照模擬物組(NC組)。siRNA的細胞轉染方法同上，3條CCNE1的siRNA靶序列分別為siRNA-1：5′-CGC ACG AGA TCT ACG ACA T-3′，siRNA-2：5′-ACA ATC GGA TGA TGA TTA A-3′，siRNA-3：5′-GCA GCA GCA TCT AGT ACC T-3′。

1.2.2實時定量逆轉錄PCR 按照Trizol試劑說明書提取細胞中總RNA。參照Takara公司PrimeScript RT-PCR kit說明書反轉錄成cDNA，然后進行實時熒光定量PCR反應。CCNE1上游引物5′-TTT CAG GGT ATC AGT GGT G-3′，下游引物5′-ACA TGG CTT TCT TTG CTC-3′；GAPDH上游引物5′-AAG GTC GGA GTC AAC GGA TT-3′,下游引物5′-CTG GAA GAT GGT GAT GGG ATT-3′。反應條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 20 s,57 ℃ 45 s,72 ℃ 45 s,擴增30個循環；94 ℃繪制熔解曲線。實驗設3個平行復孔，所有樣品重復檢測3次。

1.2.3MTT檢測細胞增殖 實驗組和對照組A549細胞消化重懸計數，以每孔5 000個分別接種入96孔板。然后分別于24、48、72、96和120 h進行如下操作：每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/L)，繼續培養4 h。吸棄上清，每孔加入150 μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀測量490 nm處各孔的光密度(OD)值。實驗每組設6個復孔，重復3次。

1.2.4流式細胞實驗檢測細胞周期 轉染36 h后細胞消化重懸離心，每管計數1×106個細胞， PBS洗滌2次；加入預冷70%乙醇4 ℃固定過夜；離心去上清，PBS清洗后加入0.05 g/L PI 50 μL，室溫避光染色30 min，流式細胞儀檢測細胞周期。

1.2.5雙熒光素酶報告基因實驗 應用在線生物信息預測軟件對hsa-miR-107可能作用的靶基因進行預測，選擇的原則是該基因具有物種保守性。預測結果顯示，miR-107 靶向結合CCNE1 3′-UTR。構建含有CCNE1 3′-UTR的psiCHECK-2載體質粒。將HEK293T細胞接種于12孔板上，細胞密度為80%～90%進行轉染。實驗分組：質粒+miR-107模擬物+脂質體(miR-107組)；質粒+NC模擬物+脂質體(NC組)。轉染30 h后終止培養，PBS洗2次，每孔細胞加入100 μL的裂解緩沖液，室溫輕微振搖15 min，收集細胞裂解液于干凈的EP管中；在白色不透光的96孔板加入20 μL樣品，加入100 μL的LARⅡ液，立刻測熒光值；將板拿出，繼續在孔中加入100 μL Stop Glo Reagent液，迅速吹打均勻，再測值。最后將所得到的數據標準化后進行分析。

1.2.6Western blot檢測CCNE1蛋白表達 將細胞用預冷的PBS 洗滌2次，RIPA 裂解液裂解細胞，用BCA蛋白濃度測定試劑盒定量蛋白。取每孔20 μg蛋白進行10% 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電脈(SDS-PAG)，將電泳分離后的蛋白轉移至硝酸纖維素膜；5%脫脂奶粉溶液室溫下封閉1 h，加入1∶1 000稀釋的單克隆抗體CCNE1和β-actin(內參照)抗體，4 ℃反應過夜；PBST洗膜3次，加入1∶1 000稀釋的二抗，室溫反應30 min；PBST 洗膜3次，應用Odyssey激光成像系統檢測蛋白條帶。實驗重復3次。

2 結 果

2.1過表達miR-107對細胞增殖的影響 轉染48 h后，OV-miR-107組較KD-miR-107組和NC組明顯抑制細胞的增殖(P<0.05)，濃度25～100 nmol/L呈較為明顯的劑量依賴性，濃度超過100 nmol/L后OV-miR-107對細胞增殖的抑制能力基本保持穩定，后續實驗采用100 nmol/L的濃度。細胞經100 nmol/L濃度轉染后，在不同時間點OV-miR-107組較KD-miR-107組和NC組對細胞增殖能力的抑制呈現明顯的時間依賴性(P<0.05)，在72 h時抑制細胞增殖能力最明顯，見圖1。

A:不同濃度模擬物轉染48 h后各組OD值；B：miR-107過表達模擬物轉染濃度為100 nmol/L時，不同時間點OD值

圖1過表達miR-107對細胞增殖的影響

A：OV-miR-107組；B：KD-miR-107組；C：NC組；D：各組細胞周期占比情況

圖2過表達miR-107對細胞周期的影響

2.2過表達miR-107對細胞周期的影響 細胞轉染36 h后,OV-miR-107組、KD-miR-107組和NC組細胞G0G1所占比例分別為(68.880±0.175)%、(40.830±0.271)%和(46.160±0.182)%，差異有統計學意義(P<0.05)。OV-miR-107組細胞S期及G2M期所占比均少于KD-miR-107組和NC組(P<0.05)，見圖2。

圖3 雙熒光素酶報告基因檢測miR-107與CCNE1 3′-UTR的結合位點

2.3過表達miR-107對細胞CCNE1 mRNA和蛋白表達的影響 生物信息學網站顯示CCNE1的3′-UTR區域246～253 bp是miR-107的結合位點，miR-107組海腎熒光素酶(RL)/螢火蟲熒光素酶(FL)值小于NC組(P<0.05)，見圖3。miR-107組CCNE1 mRNA和具體數值蛋白表達水平均較NC組低，見圖4。

2.4siRNA轉染后細胞CCNE1 mRNA表達 siRNA轉染36 h后，參照陰性對照組，轉染靶向CCNE1的3條siRNA的CCNE1 mRNA表達水平均明顯降低(P<0.05)。3條siRNA中，siRNA-2的siRNA沉默效果最好，其干擾效率達到(82.0±0.3)%，后續實驗采用siRNA-2，見圖5。

A：實時定量逆轉錄PCR檢測CCNE1 mRNA表達；B：Western blot檢測CCNE1蛋白表達

圖4過表達miR-107對細胞CCNE1 mRNA和蛋白表達的影響

圖5 轉染siRNA后各組細胞CCNE1 mRNA表達

2.5CCEN1 siRNA對細胞增殖和周期的影響 siRNA轉染后24 h，NC-siRNA組和siRNA-2組對細胞的增殖抑制無明顯區別，但在48、72和96 h，siRNA-2組對細胞增殖的抑制明顯強于NC-siRNA組(P<0.05)。siRNA轉染36 h后，siRNA-2組細胞G0G1期所占比例明顯高于NC-siRNA組，而siRNA-2組細胞S期和G2M期細胞占比明顯低于NC-siRNA組(P<0.05)，見圖6。

圖6 CCEN1 siRNA對細胞增殖和周期的影響

3 討 論

非小細胞肺癌是最常見的肺癌類型，但早期不易發現，患者確診時往往已經處于中晚期，失去手術機會，于是化療和分子靶向治療為其主要治療手段。對于常規化療無效或不能耐受聯合化療的晚期患者，化療的效果非常有限且療效較差，故這部分患者的5年生存率非常低[2]。根據分子生物學的信號轉導通路發現的靶向藥物治療非小細胞肺癌展現了一定的優越性，如吉非替尼，但是以往報道稱吉非替尼只能抑制腫瘤的生長而不會使腫瘤最終得到緩解。這是因為腫瘤的發生和發展是一個非常復雜的過程，吉非替尼僅針對酪氨酸激酶傳導通路，所起的治療作用也就有一定的局限性。很多學者對非小細胞肺癌中的差異表達的miRNAs進行深入研究并探索其發生的機制，以期望能夠通過miRNAs 檢查篩選早期非小細胞肺癌和進一步指導靶向藥物治療的研發。

筆者通過查閱文獻發現miR-107在多種腫瘤中呈低表達，如胃癌、乳腺癌、肺癌等[9-12]，在一定程度上說明miR-107的異常表達可能與這些腫瘤的發生和發展有關聯。XIA等[11]通過研究證實miR-107在30例非小細胞肺癌臨床標本和細胞系中呈低表達，同時發現miR-107能靶向抑制BDNF表達，進一步阻滯PI3K/AKT信號通路，最終抑制非小細胞肺癌細胞的侵襲能力。ZHANG等[12]發現miR-107靶向抑制CDK8后非小細胞肺癌細胞對化療藥物順鉑的敏感性增加。這些研究結果說明miR-107在非小細胞肺癌發生和發展中扮演著抑癌基因的作用。為證實這一結論，筆者在A549細胞中分別過表達和下調miR-107行細胞功能實驗。MTT實驗結果顯示過表達miR-107組細胞較下調miR-107組和陰性對照組明顯抑制了細胞的增殖，流式細胞周期結果顯示過表達組較下調miR-107組和陰性對照組明顯阻滯了更多的細胞停留在G0G1期，細胞功能學實驗證實miR-107在非小細胞肺癌中發揮著抑癌基因的作用。

為了探討過表達miR-107能夠抑制細胞增殖和阻滯細胞周期的具體機制，筆者通過targetscan、miRanda和miRBase生物信息學網站對miR-107下游靶基因進行預測，3個數據庫結果交集發現CDK8和CCNE1序列上均有miR-107明確的結合位點。因為miRNA通過其序列5′-端的堿基可與多個基因的mRNA的靶點結合，即一個miRNA可與多個靶基因相結合。CDK8是細胞周期的調控因子，可激活Cyclin C，作用于G1S期，調控正常細胞周期，對于CDK8在肺癌組織中表達情況還未有大樣本臨床資料報道。CCNE1屬于細胞周期蛋白家族中的一員，細胞周期蛋白是調控細胞周期和變構激活周期蛋白依賴性激酶所必需的蛋白，是調控細胞從G0G1期到S期轉換過程中最基本和最廣泛的限速調節因子，CCNE1通過特異性結合和激活CDK2，正性調控使細胞從G0G1期進入到S期。文獻報道在肺癌組織中CCNE1呈過表達狀態[13]，同時在非小細胞肺癌中常?？梢杂^察到細胞組織紡錘體和中心體異常，這是因為細胞中大量表達CCNE1引起的[14]。也就是說CCNE1在肺癌的發生、發展中可能扮演著促癌基因的角色。而且目前還沒有文獻報道miR-107對CCNE1基因的調控機制。筆者構建含有CCNE1基因3′-UTR片段的psiCHECK-2/CCNE1 3′-UTR質粒，轉染293T細胞后行雙熒光素酶報告基因實驗，實驗結果提示miR-107能直接結合質粒的CCNE1的3′-UTR片段。鑒于雙熒光素酶實驗只能驗證外源miRNA和外源CCNE1 3′-UTR的結合位點，筆者檢測了miR-107組和NC組CCNE1 mRNA和蛋白表達水平。本實驗結果提示miR-107組細胞CCNE1 mRNA和蛋白表達水平較NC組明顯下調，說明miR-107能直接結合CCNE1的3′-UTR區域，介導其mRNA的降解，并最終下調蛋白水平。

本文將CCNE1 siRNA轉染至A549細胞，通過實時熒光定量PCR選擇siRNA-2序列進行后續細胞功能實驗。MTT檢測結果顯示，轉染siRNA-2的A549細胞增殖能力明顯低于對照組，且其生長抑制隨轉染時間的延長而增加。流式周期顯示siRNA-2組較對照組阻滯更多細胞停留在G0G1期。細胞周期中G1S期轉換的交界點是細胞生長調控的關鍵調控點，而CCNE1在非小細胞肺癌細胞高表達將會導致細胞的無限制增殖。

綜上所述，CCEN1是細胞周期中重要的調節因子，miR-107靶向調節CCNE1影響A549細胞的增殖和調控細胞周期，進一步證實miR-107是介導肺癌發生、發展的重要miRNA，并可能起著抑癌基因的作用。但miR-107對CCNE1具體調控機制，以及在CCNE1調控的G1/S交界點是否有特定因子的失調、缺失或過表達，都有待于進一步探索。

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