小青龍湯對(duì)哮喘模型小鼠氣道上皮細(xì)胞表達(dá)TSLP的影響研究*

宋桂華，張 巖，于素平，呂偉剛，管志偉，梅曉峰，孫萌萌，王 晶

(河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科，鄭州 450000)

支氣管哮喘(簡(jiǎn)稱(chēng)哮喘)是一種由嗜酸性粒細(xì)胞(EOS)、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞等多種細(xì)胞及其他相關(guān)細(xì)胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病，其中氣道上皮細(xì)胞不僅是哮喘炎癥形成的直接參與者，同時(shí)也是哮喘炎癥特定的靶細(xì)胞與可被吸入性刺激物(包括抗原/過(guò)敏原)直接激活的炎癥細(xì)胞[1]。胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素(TSLP)是一種由氣道上皮分泌的細(xì)胞因子，既往已有大量研究證實(shí)，TSLP在哮喘患者中的表達(dá)水平明顯增高[2-3]。當(dāng)前西醫(yī)治療哮喘主要包括應(yīng)用支氣管舒張劑、控制感染及免疫治療等，療效尚可，但有相當(dāng)比例患者在治療過(guò)程中可觀察到明顯的不良反應(yīng)，或?qū)⒋碳は∏榧又豙4]。近年來(lái)，中醫(yī)藥治療哮喘因不良反應(yīng)輕微而被廣泛關(guān)注，進(jìn)一步深入探討對(duì)癥哮喘的合理中藥組方具有重要臨床意義與社會(huì)效益。小青龍湯是治療哮喘的經(jīng)典方劑之一，但目前尚未見(jiàn)關(guān)于小青龍湯影響氣道上皮細(xì)胞表達(dá)TSLP的相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察小青龍湯對(duì)哮喘模型小鼠氣道上皮細(xì)胞表達(dá)TSLP的影響，旨在為臨床運(yùn)用小青龍湯治療哮喘提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雌性BALB/C小鼠[上海加科生物科技有限公司，無(wú)特定病原體級(jí)(SPF級(jí))]30只，6～8周齡，體質(zhì)量(20.2±2.5)g。同室飼養(yǎng)，自然光照明，飼養(yǎng)室溫度18～22 ℃，相對(duì)濕度50%～70%。

1.1.2藥物與試劑 小青龍湯煎劑藥物組成為麻黃9 g，桂枝9 g，白芍9 g，細(xì)辛3 g，甘草6 g，干姜6 g，半夏9 g，五味子6 g；所有藥物經(jīng)浸泡、煎熬、過(guò)濾及濃縮成100 mL藥汁，置于4 ℃冰箱保存。按人與動(dòng)物體表面積折算的等效劑量比值進(jìn)行計(jì)算，以70 kg成人66 g生藥為標(biāo)準(zhǔn)，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用于小鼠的生藥標(biāo)準(zhǔn)為0.6 g/100 g。其他藥物與試劑主要包括：卵白蛋白(OVA，Ⅳ級(jí)，美國(guó)Sigma公司)，滅活百日咳桿菌(北京生物研究所)，氫氧化鋁(分析純，福晨化學(xué)試劑廠)，4%多聚甲醛(自配)，0.01 mol/L PBS(pH 7.2，自配),Trizol(美國(guó)Invitrogen公司),RT-PCR(SYBR Green)試劑盒(美國(guó)BIO-RED公司),逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Thermo公司),乙基苯基聚乙二醇、脫氧膽酸鹽、十二烷基硫酸鈉(SDS,上海康朗生物科技有限公司),TSLP抗體(ab59377，美國(guó)Abcam公司)。

1.1.3儀器 402型超聲霧化器(上海魚(yú)躍醫(yī)療設(shè)備有限公司)；F6-10型手握式電動(dòng)勻漿機(jī)(德國(guó)FLUKO 公司)；DHP-9012B型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；PTC-150型PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)MJR公司)；ZF-4型紫外分光光度計(jì)(上海長(zhǎng)明光學(xué)電子儀器廠)；Kodsk型凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)BIO-RAD公司)；OLYMPUS光學(xué)顯微鏡與照相顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；電泳槽(北京東方特力科貿(mào)中心)；BDF-1600型電泳儀(北京東方儀器廠)；ABI-7500型RT-PCR檢測(cè)儀(美國(guó)ThemoFisher公司)。

1.2方法

1.2.1分組與造模 將小鼠分為空白對(duì)照組、哮喘模型組、小青龍湯組，每組10只。哮喘模型組與小青龍湯組于第1、8天采用OVA 10 mg與氫氧化鋁凝膠200 mg進(jìn)行皮下注射，另采用5×109個(gè)滅活百日咳桿菌腹腔注射致敏[5]。自第15天開(kāi)始，將全部小鼠放置到密閉玻璃箱內(nèi)，采用含OVA(2%)的生理鹽水50 mL經(jīng)超聲霧化器霧化吸入激發(fā)哮喘，每天1次，每次30 min，持續(xù)8周。OVA的生理鹽水霧化液濃度每2周增加1%。空白對(duì)照組均以不含OVA的生理鹽水替代。小青龍湯組采用小青龍湯水煎液于每日激發(fā)哮喘前1 h灌胃，給藥劑量以小鼠體質(zhì)量計(jì)為0.5 mL/100 g。

1.2.2標(biāo)本采集與染色鏡檢 末次激發(fā)哮喘24 h內(nèi)將各組小鼠麻醉解剖，快速剝離肺組織，剪開(kāi)氣管并將支氣管取出。于肺組織右側(cè)灌注6%多聚甲醛進(jìn)行固定，之后再放置到4%多聚甲醛中保存?zhèn)溆谩２杉谓M織標(biāo)本，將部分經(jīng)石蠟包埋處理后的標(biāo)本進(jìn)行常規(guī)蘇木精-伊紅染色法(HE)染色鏡檢。

1.2.3免疫熒光檢測(cè)支氣管TSLP 表達(dá) 取支氣管組織50 mg置于PBS中，室溫浸泡30 min，滴加稀釋好的正常血清，室溫封閉30 min，加一抗，室溫避光孵育10～12 h，洗片，加熒光二抗，室溫避光孵育1 h，洗片4次，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

1.2.4qRT-PCR檢測(cè)肺組織TSLP mRNA表達(dá) 參照Trizol試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行肺組織總RNA提取，反轉(zhuǎn)錄cDNA，在PCR儀上擴(kuò)增。應(yīng)用primer Premier 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。TSLP:上游引物5′-GAC CTG ACT GGA GAT TTG-3′，下游引物5′-CAT TGA GGG CTT CTC TTG-3′；β-actin：上游引物5′-ATC ACT GCC ACC CAG AAG-3′，下游引物5′-TCC ACG ACG GAC ACA TTG-3′。qRT-PCR反應(yīng)體系采用SYBR Green，循環(huán)條件為95 ℃ 10 s、95 ℃ 15 s、60 ℃ 45 s，共40個(gè)循環(huán)。繪制熔解曲線(xiàn)，獲得TSLP及內(nèi)參β-actin的熒光域值循環(huán)數(shù)(Ct值)，計(jì)算其均值的比值，ΔCt=CtTSLP-Ctβ-actin，數(shù)值為mRNA的增殖拷貝數(shù)倍數(shù)。

1.2.5Western blot檢測(cè)肺組織TSLP蛋白表達(dá) 稱(chēng)取各組小鼠肺組織50 mg，加RIPA蛋白裂解液(1%乙基苯基聚乙二醇、0.5%脫氧膽酸鹽和0.1%十二烷基硫酸鈉加入PBS中)500 μL，經(jīng)搖動(dòng)、離心、取上清液，提取蛋白。10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳后，用轉(zhuǎn)濕儀轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜。5%脫脂奶室溫4 ℃封閉過(guò)夜，加一抗，水平搖床平緩搖動(dòng)2 h，TBS-Tween洗膜3次，加二抗搖床平緩搖動(dòng)2 h，TBS-Tween洗膜3次，應(yīng)用發(fā)光劑在X線(xiàn)片上曝光、顯影、定影。

2 結(jié) 果

2.1肺組織標(biāo)本的HE染色及鏡檢情況 哮喘模型組支氣管與血管周?chē)⒎伍g質(zhì)及肺泡腔均觀察到明顯的以EOS和淋巴細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，支氣管黏膜皺折增多且其下出現(xiàn)水腫，肺泡隔與氣道平滑肌顯著增厚，部分黏膜上皮細(xì)胞發(fā)生脫落；小青龍湯組與哮喘模型組有相似改變，但程度明顯減輕；空白對(duì)照組幾乎未發(fā)生組織結(jié)構(gòu)改變，各級(jí)支氣管上皮基本完整，見(jiàn)圖1。

2.2支氣管TSLP 表達(dá)的免疫熒光檢測(cè) 小鼠支氣管上皮細(xì)胞膜上TSLP熒光染色在哮喘模型組呈強(qiáng)陽(yáng)性，小青龍湯組呈弱陽(yáng)性，空白對(duì)照組呈陰性，見(jiàn)圖2。

A：哮喘模型組；B：小青龍湯組；C：空白對(duì)照組

圖1各組小鼠肺組織標(biāo)本的HE染色及鏡檢情況

A：哮喘模型組TSLP染色；B：哮喘模型組DAPI核染；C：哮喘模型組合成圖；D：小青龍湯組TSLP染色；E：小青龍湯組DAPI核染；F：小青龍湯組合成圖；G：空白對(duì)照組TSLP染色；H：空白對(duì)照組DAPI核染；I：空白對(duì)照組合成圖

圖2各組小鼠支氣管TSLP表達(dá)的免疫熒光檢測(cè)

2.3各組小鼠肺組織TSLP mRNA表達(dá) 與哮喘模型組小鼠肺組織TSLP mRNA表達(dá)(3.880±0.467)比較，小青龍湯組(2.932±0.455)與空白對(duì)照組(2.750±0.522)均降低(P<0.05)，小青龍湯組略高于空白對(duì)照組，但組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖3。

2.4各組小鼠肺組織TSLP蛋白表達(dá) 小青龍湯組與空白對(duì)照組小鼠肺組織TSLP蛋白表達(dá)均低于哮喘模型組(P<0.05)，小青龍湯組較空白對(duì)照組略高，但組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖4。

圖3 各組小鼠肺組織TSLP mRNA表達(dá)

圖4 各組小鼠肺組織TSLP蛋白表達(dá)

3 討 論

目前公認(rèn)的結(jié)論為，哮喘是一種由EOS、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞等多種細(xì)胞及其他相關(guān)細(xì)胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與既往報(bào)道一致[6-8]，與空白對(duì)照組比較，哮喘模型組的小鼠肺支氣管與血管周?chē)⒎伍g質(zhì)及肺泡腔均觀察到明顯的以EOS和淋巴細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，支氣管黏膜皺折增多且其下出現(xiàn)水腫，肺泡隔與氣道平滑肌顯著增厚，部分黏膜上皮細(xì)胞發(fā)生脫落。上述改變符合臨床哮喘病理特征，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)造模方法可行。

Th1/Th2功能失衡在哮喘發(fā)病中扮演重要角色，Th2優(yōu)勢(shì)應(yīng)答所導(dǎo)致的EOS性氣道炎癥為變應(yīng)性哮喘的基本特征之一[9-11]。TSLP是于1994年由Friend等從小鼠胸腺基質(zhì)細(xì)胞中首次鑒定出的一種與白細(xì)胞介素(IL)-17極為類(lèi)似的細(xì)胞因子，主要表達(dá)于上皮細(xì)胞，其中經(jīng)抗原激活的支氣管上皮細(xì)胞及肺成纖維細(xì)胞表達(dá)TSLP最為活躍[12]。有學(xué)者在進(jìn)行哮喘模型小鼠RNA分離時(shí)發(fā)現(xiàn)，TSLP mRNA表達(dá)水平較正常小鼠顯著上調(diào)，且TSLP高水平表達(dá)可導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因小鼠氣道出現(xiàn)超敏反應(yīng)[13]。臨床研究進(jìn)一步證實(shí)，哮喘患者氣道TSLP明顯增加，而將TSLP受體(TSLPR)人為阻斷后可一定程度控制氣道的變態(tài)反應(yīng)性炎癥[14]。另有研究發(fā)現(xiàn)，在樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)表面存在有TSLPR，其為Ⅰ型細(xì)胞因子受體蛋白，具有該族受體分子的典型結(jié)構(gòu)特征，如胞外區(qū)的半胱氨酸(Cys)殘基序列與近膜區(qū)的WSXWS保守序列等[15]。TSLP與TSLPR的結(jié)合可將轉(zhuǎn)錄因子STAT3、STAT5激活，繼而啟動(dòng)下游基因表達(dá)。TSLP還可與DC直接相互作用，被認(rèn)為是DC的激活劑[16]。TSLP對(duì)CDllc+DCs(TSLP-DC)具活化作用，并使其在活化后增加CD40、CD80及CD86的表達(dá)水平，這將促使初始CD4+T細(xì)胞向Th2型細(xì)胞分化，Th2型細(xì)胞則能進(jìn)一步產(chǎn)生IL-4、IL-5、IL-13等多種炎性因子，繼而導(dǎo)致以EOS為主的炎癥細(xì)胞聚集并使氣道發(fā)生或加重炎癥[17]。

祖國(guó)中醫(yī)學(xué)將哮喘稱(chēng)作“哮病”，認(rèn)為其主要病機(jī)為痰飲內(nèi)伏導(dǎo)致的肺、脾、腎三臟功能失調(diào)，氣機(jī)升降失利，氣痰搏結(jié)于喉間，以致氣息喘促而發(fā)生哮喘。《素問(wèn)·咳論》曰：“其寒飲輸入胃，從肺脈上至于肺則肺寒，肺寒則內(nèi)外和邪，因而客之，則為肺咳”[18]。小青龍湯出自醫(yī)圣張仲景的《傷寒雜病論》，乃醫(yī)治“外寒內(nèi)飲”之經(jīng)典方劑。方中麻黃發(fā)汗、平喘、利水，配桂枝則增強(qiáng)通陽(yáng)宣散之力，桂枝配芍藥調(diào)和營(yíng)衛(wèi)，干姜、細(xì)辛為熱藥則散寒溫肺化飲，五味子斂肺止咳，半夏燥濕化痰、降逆止嘔，甘草調(diào)和諸藥，諸藥合用則溫肺化飲、止咳平喘。本研究發(fā)現(xiàn)，哮喘模型小鼠的支氣管TSLP 表達(dá)及肺組織TSLP mRNA和TSLP蛋白表達(dá)均明顯增高，而經(jīng)小青龍湯干預(yù)后TSLP 表達(dá)被明顯抑制。

綜上所述，小青龍湯對(duì)哮喘模型小鼠氣道上皮細(xì)胞表達(dá)TSLP具有明顯抑制作用，可有效控制氣道炎癥并改善哮喘癥狀。本實(shí)驗(yàn)研究不僅進(jìn)一步揭示了小青龍湯治療哮喘的可能性作用機(jī)制，也為古方的現(xiàn)代應(yīng)用提供了一定的科學(xué)依據(jù)。

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