硫代乙酰胺誘導的急性肝損傷大鼠肝組織Norrin/Frizzled-4表達的變化*

胡建鵬，宋正己，李玉蓮，尋琳婷，趙雪茹，張镕

急性肝損傷（acute liver injury）是指在無慢性肝病基礎上，由多種病因導致肝臟細胞損傷，肝臟解毒、生物轉化、合成和排泄等功能出現障礙。造成急性肝損傷的原因主要包括病毒感染、休克缺血、食物或藥物中毒、放射線損傷、妊娠、酒精攝入過量以及肝外組織器官功能障礙間接造成肝損傷等。肝臟有著極強的再生和修復能力，去除急性肝損傷病因后，在短期內組織重建即可完成，組織結構恢復。Norrie病是一種先天性視網膜血管發育不全，視網膜血管擴張、血管增殖、纖維化和視網膜脫離的疾病，是由Norrin蛋白相關基因（Ndp）缺陷，正常視網膜血管發育過程中斷，視網膜處于缺氧狀態，啟動了病理性血管新生而導致的疾病[1，2]。Norrin蛋白是一種小分子的分泌型糖蛋白質，能通過自分泌和/或旁分泌方式作用于血管內皮細胞和血管周圍細胞，決定靶細胞的移行、增殖和血管網絡形成等生物行為，在中樞Norrin還有促神經生長因子樣作用[3，4]。在Norrin基因缺陷小鼠引入外源性Norrin基因可以恢復視網膜血管網的形成，并且所形成的視網膜血管結構，包括超微結構都是正常的，能完全恢復正常的視網膜血管網絡結構和維持視網膜功能[5]。近年國外研究報道，活化的肝星狀細胞（hepatic stellate cells，HSC）存在 Wnt/β-catenin 信號通路的激活，阻斷該信號可抑制HSC的活化[6]。已有研究認為細胞外Norrin蛋白通過與細胞膜上特異性跨膜受體卷曲蛋白4（Frizzled-4）結合，能介導Norrin/Fri-zzled-4信號通路，調控轉錄過程，與血管內皮細胞和血管周圍細胞的遷移、增殖和血管網絡形成相關。Norrin/Frizzled-4在血管新生（angiogenesis）及發育過程中起到關鍵性作用[3，7，8]。近年來，有關 Norrin基因在正常血管發育中的作用研究已取得突破性進展，但Norrin/Frizzled-4信號在急性肝損傷組織血管新生和肝間質重建中的作用還鮮有報道。本研究采用硫代乙酰胺（thioacetamide，TAA）誘導大鼠急性肝損傷，觀察了肝組織Norrin/Frizzled-4蛋白、血管內皮細胞生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和CD105表達的變化及其與肝組織血管新生之間的關系，以便進一步研究Norrin/Friz-zled-4信號在急性肝損傷間質重建中的作用及其調控途徑。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、試劑與儀器 健康SPF級雄性SD大鼠33只，體質量200±20 g，購自成都達碩生物科技有限公司，動物合格證號SCXK（川）2013-24。在云南省中醫醫院中心實驗室無菌動物房飼養，適應1 w后開始實驗。TAA購自美國Sigma公司；Nycodenz粉劑（挪威 Axis-Shield）；Hanks、D-Hanks、鏈蛋白酶 E（Solarbio）；Collagenase Ⅳ（美國 MP原裝）；DNaseI（Roche）；檢測 VEGF 和 CD105的ELISA試劑盒（R&B公司進口分裝），SDS-PAGE凝膠配制試劑盒和BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天）；抗 Norrin和抗 Frizzled-4（Chem Cruz）。熒光顯微鏡、倒置相差顯微鏡（德國萊卡）；超低溫冰箱、小型臺式離心機（美國Thermo）；電泳儀、小型Trans-blot轉達印槽組件（美國Bio-rad）；紅外雙色激光成像系統Odyssey Clx（美國 LICOR）；Epoch連續波長酶標儀（美國Bio-Tek）；漩渦混合儀（上海QT-1）；SW-CJ-2F標準化超凈工作臺。

1.2 原代肝星狀細胞的分離 取1只大鼠，正常飼養至450±50 g后，用Hanks液在體灌洗大鼠肝臟，離體后用0.05% Ⅳ型膠原酶、0.02%鏈蛋白酶E和0.05%DNaseI灌注、消化大鼠肝臟，經12%Nycodenz密度梯度離心，收集肝星狀細胞層，洗滌、離心后，提取細胞總蛋白。

1.3 急性肝損傷動物模型的制備 將32只大鼠隨機分成正常對照組（N組）8只，根據大鼠體質量給予 0.9%生理鹽水5 ml·kg-1·d-1腹腔注射；TAA 誘導模型組（M組）24只，根據大鼠體質量給予TAA 250 mg·kg-1·d-1腹腔注射，1 次 /d，連續注射 3 天，誘導急性肝損傷。于開始注射TAA后的第10 d和第17 d，分別給予10%水合氯醛麻醉。在N組，處死大鼠4只，在M組，處死6只，取肝組織，經4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片，常規HE染色，顯微鏡下觀察。

1.4 血清CD105和VEGF水平檢測 麻醉大鼠后開腹，經心臟取血，3500 r/m離心15 min，取上清，采用ELISA法檢測。根據標準曲線，求出各樣品CD105和VEGF水平。

1.5 肝組織Norrin和Frizzled-4蛋白表達檢測 采用Western blot法，取肝右葉最大橫切面處組織100 mg，加入含1%PMSF的RIPA裂解液（增強型，P0013B）1 mL，冰上充分勻漿，離心后取上清。測定蛋白濃度，蛋白定量后計算各樣品體積，確保每個蛋白樣品的上樣量一致。按4：1的比例加入5×SDS-PAGE Ladding buffer，混勻。沸水浴致蛋白變性10 min，冷卻后，置于-70℃冰箱，待用。配制體積分數為12%SDS-PAGE分離膠和5%濃縮膠，灌膠凝固后，取Marker 8μL，蛋白樣品 25 μL（50μg），依次排序上樣，用恒壓45 v電壓，電泳時間約30 min，待Marker顯示樣品經過濃縮膠后將恒壓調至60 v，繼續電泳，確定已將目的蛋白條帶分開，停止電泳。按照轉膜夾陰極（黑色面）、1層海綿、2層濾紙、凝膠、PAGE膜、2層濾紙、1層海綿、轉膜夾陽極（白色面）的順序，一層層趕走氣泡，夾好固定后，將轉膜夾放入轉膜槽，放入冰袋，蓋好盒蓋后，置于4℃冰箱，恒壓90 v轉膜90 min。轉膜結束后，將目的蛋白條帶剪下，放入用TBST配制的3%牛血清蛋白封閉液中，做好標記，置于搖床上，室溫搖晃封閉1～1.5 h。分別加入抗Frizzled-4多克隆抗體（1：200）、抗 Norrin多克隆抗體（1：200）和抗 GAPDH 單克隆抗體（1：2000），搖床上4℃冰箱中孵育過夜。次日，用TBST洗膜3次，每次 10 min。加入相應酶標二抗（1：10000），用TBST洗膜3次，每次10 min。提前20 min打開紅外雙色激光成像系統，將膜放入掃描儀內，掃描成像。以Norrin/Frizzled-4條帶灰度值與內參GAPDH條帶灰度值的比值估計Norrin/Frizzled-4蛋白相對表達量。

1.6 統計學處理 應用Excel 2007和SPSS 18.0軟件，計量資料以（±s）表示，采用方差分析及t檢驗，P＜0.05為組間存在顯著性差異，P＜0.01為存在非常顯著性差異。

2 結果

2.1 大鼠生長情況 對照組大鼠活動正常，毛發光澤，飲食飲水及大小便正常，飼養期間體質量穩定增加；24只TAA誘導急性肝損傷模型大鼠于開始注射 TAA 后的第 3 d、4 d、5 d、6 d，分別死亡 2只、5只、3只、1只（45.8%）；給藥期間動物活動減少，食欲不振，嗜睡，毛發蓬亂無光澤。在注射TAA后體質量急速下降，停止注射TAA 2 d后又緩慢上升，但始終低于對照組。

2.2 各組肝組織病理學表現 正常組動物肝小葉存在，以中央靜脈為中心，肝索呈放射狀排列、整齊（圖1A）；TAA誘導急性肝損傷1 w，大鼠肝細胞部分腫脹壞死，細胞質疏松化，細胞核內出現空泡（圖1B）；TAA誘導急性肝損傷2 w，大鼠肝細胞腫脹嚴重，排列紊亂，胞內出現大空泡，細胞核體積變小，有炎性細胞浸潤（圖1C）。

圖1 各組大鼠肝組織病理學表現（HE，40×）

2.3 血清CD105和VEGF水平比較 與正常對照組比，急性肝損傷1 w組大鼠血清CD105和VEGF水平顯著升高（P＜0.05），急性肝損傷2 w組大鼠血清CD105和 VEGF 水平極顯著升高（P＜0.01），且 1 w組和2w組比較，血清中VEGF水平也有差異顯著（P＜0.05，表1）。

表1 各組血清CD105和VEGF水平（±s）比較

表1 各組血清CD105和VEGF水平（±s）比較

與對照組比，①P＜0.05，②P＜0.01

只 CD105（ng/mL） VEGF（pg/mL）正常對照 8 2.175±0.046 61.476±0.388急性肝損傷1 w 13 2.359±0.067① 62.093±0.54急性肝損傷2 w 8 2.421±0.033② 64.520±0.252②

2.4 肝組織Norrin/Frizzled-4蛋白表達情況 結果顯示，原代肝星狀細胞和正常肝組織不表達Norrin蛋白或Frizzled-4蛋白，或表達量很低；急性肝損傷1 w和2 w組肝組織Norrin蛋白相對表達量顯著高于正常肝組織，差異有統計學意義（P＜0.01，圖2、圖3）。急性肝損傷2 w組Norrin蛋白表達量顯著低于1 w組（P＜0.05），說明急性肝損傷后肝組織Norrin蛋白表達逐漸降低。正常大鼠肝組織Frizzled-4蛋白高表達，提示除HSC外肝臟內可能還存在其他間質細胞或實質細胞參與Frizzled-4蛋白的表達。急性肝損傷大鼠肝組織Frizzled-4蛋白相對表達量顯著高于正常肝組織，差異有統計學意義（P＜0.01，圖 2、圖 3）。

圖2 各組肝組織Norrin/Frizzled-4蛋白相對表達量比較

圖3 各組肝組織Norrin/Frizzled-4蛋白表達

3 討論

本研究發現急性肝損傷大鼠血清CD105和VEGF水平升高，說明肝組織代償性啟動血管新生，促進肝間質重建[9]。在急性肝損傷時，庫普弗細胞和內皮細胞被激活并產生 TGF-β1、PDGF、VEGF、腫瘤壞死因子（TNF）等細胞因子以及炎性介質和活性氧，促使靜止的HSC活化，活化的HSC具有血管平滑肌細胞特性，能促進新生血管的構建[10-13]。

經典WNT/β-catenin信號通路是細胞外配體（WNT蛋白家族）作用于跨膜卷曲蛋白-低密度脂蛋白相關蛋白復合受體（Frizzled/LRP），使Dishevelled蛋白被激活。當β-catenin降解復合體被抑制后，β-catenin信號得以在胞漿內累積并傳導至細胞核，與核內轉錄因子TCF/LEF1相互作用，激活下游靶基因的轉錄，引發生物學效應[14-16]。Norrin蛋白在結構上和Wnt蛋白無關，但也是Frizzled-4蛋白在細胞外的一種配體蛋白，能激活Norrin/Frizzled-4信號通路。Norrin/Frizzled-4和Wnt/β-catenin信號通路的協同分子和靶分子不盡相同[17]，Norrin/Frizzled-4信號轉導通路在血管發生和功能維護中起核心作用[3，14]。

本研究結果顯示，Norrin蛋白在肝星狀細胞和正常肝組織中表達量低，損傷初期其表達量上調，之后又有所下降。除HSC外，肝臟內可能還存在其他間質細胞或實質細胞參與Frizzled-4蛋白的表達[18]。文獻報道Norrin/Frizzled-4信號轉導通路在血管發生和功能維護中起核心作用[3，14，19]。我們還觀察到Frizzled4蛋白表達與CD105和VEGF具有同步性，急性肝損傷均可顯著上調其表達量，參與急性肝損傷后的血管新生，推測Norrin/Frizzled4和WNT/β-catenin信號在肝損傷血管新生和間質重建的不同時期發揮作用，而且其作用機制可能是在急性肝損傷后上調CD105和VEGF表達，促進血管新生和組織修復。

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