DT390與TMTP1融合蛋白靶向治療卵巢癌的實驗研究

葉雙梅 馬湘一 王世宣

卵巢癌是常見的婦科惡性腫瘤，由于早期癥狀不明顯，多數患者臨床確診時已為晚期［1］，死亡率高居女性生殖系統惡性腫瘤之首［2］。鉑類藥物如順鉑是目前卵巢癌治療的主要藥物之一，由于化療不良反應較大及多藥耐藥性的出現，卵巢癌的化療效果受限［3］，患者的5年生存率仍無明顯提高［4］。因此，迫切需要尋找新的有效治療方法。靶向治療能提高病灶局部的藥物濃度，減少毒副反應，使藥物能安全有效地發揮作用［5］，在晚期腫瘤及難治性腫瘤的治療方面顯示了巨大的應用前景。本研究利用本課題組前期研究中發現的一種能特異性結合高轉移潛能腫瘤細胞的新型靶向肽TMTP1，通過體內外實驗探討白喉毒素（diphtheria toxin，DT）片段DT390與靶向肽TMTP1的融合蛋白對卵巢癌的靶向治療效果，為探索卵巢癌新的治療方法提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 卵巢癌細胞株OV2008和C13*由加拿大渥太華癌癥中心的Dr.Rakesh Goel贈送。

1.1.2 主要試劑 含有白喉毒素全長序列的質粒由本實驗室保存。TMTP1靶向肽由西安華辰生物科技有限公司合成。MTT與Heochst 33342購自美國Sig?ma公司，Annexin V/PI和TUNEL細胞凋亡原位檢測試劑盒均購自南京凱基生物科技發展有限公司，酶標儀購自美國Hyperion公司，激光共聚焦顯微鏡購自日本Olympus公司，流式細胞儀購自美國BD Biosci?ences公司，4周齡BALB/c nu/nu小鼠購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司。

1.2 方法

1.2.1 重組載體的構建及融合蛋白的制備與鑒定 DT390-TMTP1、DT390-biTMTP1和DT390-triT?MTP1三種重組載體的構建、融合蛋白的制備和鑒定的詳細方法參照本課題組前期報道［6-7］。本研究制備了同樣純度高和活性較好的融合蛋白。

1.2.2 激光共聚焦顯微鏡觀察 參照前期實驗結果［6］，將PBS以及3 μg/mL的TMTP1、DT390-TMTP1、DT390-biTMTP1和DT390-triTMTP1分別作用于C13*及OV2008細胞，5 h后加入Heochst 33342進行細胞核染色，激光共聚焦顯微鏡觀察細胞核，拍照，存檔。

1.2.3 MTT法 收集對數生長期的C13*及OV2008細胞，調整細胞濃度為1.6×104/mL，取500 μL接種于96孔培養板，實驗組分別加入不同濃度（1、2、3、4、5 μg/mL）的TMTP1、DT390-TMTP1、DT390-biTMTP1和DT390-triTMTP1，每個濃度設3個復孔，空白對照組加等體積的PBS，調零組為不含細胞的等體積培養基，置37℃、5%CO2溫箱培養24 h，每孔加入濃度為5 mg/mL MTT溶液10 μL，培養4 h，棄上清，每孔加入150 μL DMSO，置搖床上避光輕柔搖蕩15 min，酶標儀檢測490 nm波長各孔吸光度值，計算各組細胞存活率。存活率=（處理組平均吸光度/空白對照組平均吸光度）×100%。

1.2.4 流式細胞術 6孔板內接種處于對數生長期的C13*及OV2008細胞，調整融合度為50%～60%。分別加入4 μg/mL的TMTP1、DT390-TMTP1、DT390-biTMTP1和DT390-triTMTP1，每個濃度設3個復孔，對照組加等體積的PBS，作用24 h后，采用不含EDTA的胰酶消化收集細胞，調整細胞濃度為1×106/mL，取500 μL細胞懸液，800 r/min離心5 min，使用PBS洗滌細胞1次，加入500μLBindingBuffer，再分別加AnnexinV及PI各5μL，混勻，常溫、避光反應10 min。1 h內上流式細胞儀檢測。

1.2.5 動物實驗 選用4周齡雌性BALB/c nu/nu小鼠25只，使用1 mL無菌注射器抽取細胞濃度為1.5×107/mL的C13*細胞懸液200 μL注射到裸鼠左側大腿根部皮下，3天后將裸鼠隨機分為5組，每組5只。分別腹腔注射PBS及TMTP1、DT390-TMTP1、DT390-biTMTP1和DT390-triTMTP1各10 μg，每3天注射1次，連續注射3周，每次注射前先用游標卡尺測量腫瘤最大徑及最小徑。注射2周后將各組裸鼠用乙醚麻醉后，拍照，觀察成瘤率。最后一次測量皮下瘤后，斷頸處死裸鼠，取出皮下瘤組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，制備厚8 μm的石蠟切片，計算每次測量的腫瘤體積［8］。V=4/3π×（d/2）2×（D/2），d代表腫瘤最小徑值，D代表腫瘤最大徑值，繪制腫瘤體積增長曲線。動物實驗經華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院倫理委員會審查批準。

1.2.6 TUNEL法 石蠟切片按常規方法進行脫蠟和水化，按TUNEL試劑盒操作步驟檢測裸鼠皮下瘤組織的細胞凋亡，室溫下行DAB顯色后使用蘇木精復染細胞核，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察凋亡細胞并拍照。采用H-Score法（H=I×P）對陽性表達進行半定量統計［9］，其中I為染色強度，分為0（無著色）、1（弱陽性）、2（中等強度陽性）、3（強陽性），P為每張切片陽性染色細胞百分比。

1.3 統計學分析

所有實驗數據均采用SPSS 13.5軟件進行統計學分析。計量數據以表示，多組間比較采用ANO?VA單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 卵巢癌細胞核、細胞存活和凋亡的變化

激光共聚焦顯微鏡觀察到DT390-biTMTP1和DT390-triTMTP1作用的C13*細胞發生了明顯核碎裂，OV2008細胞發生了明顯核皺縮（圖1A）。MTT結果顯示，不同濃度（1～5 μg/mL）的DT390-biTMTP1和 DT390-triTMTP1作 用 24 h，C13*（圖 1B）和OV2008（圖1C）細胞的存活率隨著濃度增加而顯著降低。同樣，流式細胞術的結果顯示4 μg/mL的DT390-biTMTP1及DT390-triTMTP1作用24 h，C13*（圖2A）及OV2008（圖2B）細胞的凋亡率顯著高于對照組（P＜0.05），并且DT390-biTMTP1組與 DT390-triTMTP1組的C13*細胞凋亡率為66.0%±12.0%與72.9%±4.6%，較OV2008細胞的55.5%±8.9%與65.1%±9.8%更高，而對照組、TMTP1組和DT390-TM?TP1組的細胞凋亡率無顯著性差異（P＞0.05）。

圖1 各組卵巢癌細胞核及細胞存活率的變化

圖2 流式細胞術檢測各組細胞的凋亡率

2.2 裸鼠皮下瘤的形成率及生長曲線

與對照組的成瘤率100%相比，DT390-biTMTP1組的46.67%±11.55%和DT390-triTMTP1組的13.33%±11.55%受到顯著抑制（P＜0.01），而DT390-TMTP1組的成瘤率86.67%±11.55%和TMTP1組的100%與對照組比較無顯著性差異（P＞0.05，圖3A）。腫瘤的生長曲線表明，DT390-biTMTP1和DT390-triTMTP1顯著抑制了卵巢癌皮下瘤的生長（P＜0.05），而TMTP1和DT390-TMTP1組與對照組比較差異均無統計學意義（P＞0.05，圖3B）。

2.3 TUNEL法檢測裸鼠皮下瘤組織中細胞凋亡

DT390-biTMTP1組和DT390-triTMTP1組的卵巢癌皮下瘤組織的TUNEL陽性表達顯著增強（圖4A～E）。而TMTP1組以及DT390-TMTP1組的TUNEL陽性表達與對照組比較無顯著性差異。H-Score評分結果顯示，與對照組10±2相比，DT390-biTMTP1組的150±20和DT390-triTMTP1組的210±30的評分顯著增加（P＜0.05），而TMTP1組的10±8以及DT390-TM?TP1組的35±10與對照組比較無顯著性差異（P＞0.05，圖4F）。

圖3 各組裸鼠成瘤率和皮下瘤生長情況

圖4 TUNEL法檢測各組裸鼠皮下瘤組織的細胞凋亡

3 討論

卵巢癌發病隱匿，腫瘤標志物特異性不高，早期診斷困難，確診時多為晚期，并且極易復發，治療效果較差［1］，患者5年生存率不超過40%［10］。耐藥是導致卵巢癌治療失敗的關鍵因素，因缺乏圍手術期有效的藥物治療，卵巢癌的病情無法從本質上得到控制和逆轉。因此，開發有效的新藥對改善卵巢癌患者的生存質量，提高患者的生存率具有十分重要的意義。近年來，將細胞毒性物質通過靶向分子運輸到病灶局部發揮作用的治療方法取得了令人鼓舞的臨床效果，如靶向藥物索拉非尼是目前國內外指南推薦的治療晚期原發性肝癌的一線藥物［11］。貝伐單抗、奧拉帕尼、尼拉帕尼等靶向藥物在卵巢癌治療中的應用，也為晚期及復發性卵巢癌患者的臨床治療帶來了新的選擇和曙光［1］。

白喉毒素是感染β噬菌體基因組的白喉棒狀桿菌所產生的外毒素，具有極強的毒性［12］?；诎缀矶舅氐陌邢蛩幬镆驯粡V泛用于腫瘤、傳染病、血液病等治療，部分藥物取得了良好的臨床療效。如ON?TAK，即白喉毒素與IL-2的融合蛋白DAB（389）IL-2早在1999年就被美國FDA批準上市用于治療成人皮膚T細胞淋巴瘤［13］。

小分子靶向肽具有高效、組織穿透性好、毒性小、免疫原性低的特性，是制備靶向藥物的理想材料［14］。本課題組前期發現了一種新型肽，由5個氨基酸組成（NVVRQ），命名為TMTP1，體內外實驗都證實TMTP1結合高轉移潛能腫瘤細胞，不能結合低轉移潛能或不轉移的腫瘤細胞［15］。本研究組前期采用基因工程技術制備DT390-TMTP1、DT390-biTMTP1以及DT390-triTMTP1融合蛋白，體內外實驗結果顯示DT390-biTMTP1和DT390-triTMTP1通過誘導細胞凋亡、抑制細胞增殖，顯著抑制了前列腺癌和胃癌生長和轉移，并且對荷瘤裸鼠腹腔注射DT390-triTMTP1后，該蛋白快速持續地聚集在腫瘤組織內，一過性出現在肝臟和腎臟組織，提示DT390-triTMTP1靶向治療效果好，對正常組織的毒副反應低［6］。

本研究采用相同的方法制備了上述三種融合蛋白，通過體內外實驗探索三者對卵巢癌的靶向殺傷作用，研究結果與前期［6］相似，即DT390-biTMTP1與DT390-triTMTP1均能顯著抑制卵巢癌的發生和發展。并且，DT390-biTMTP1和DT390-triTMTP1對順鉑耐藥細胞株的殺傷作用比對順鉑敏感細胞株更顯著，提示在鉑類耐藥型卵巢癌的治療方面，兩種融合蛋白都具備良好的深入研究價值和臨床轉化潛能。同樣，DT390-TMTP1也未能顯示有效的治療效果。原因可能是一個小分子量的TMTP1肽（5個氨基酸）難以帶動相對巨大的DT390毒性分子（390個氨基酸）靶向結合并進入目標細胞內，或者是在DT390-TMTP1的空間構象中，DT390片段遮擋了TMTP1的結合位點，導致DT390-TMTP1不能與靶細胞結合。

綜上所述，本研究通過體內外實驗證實了DT390-biTMTP1及DT390-triTMTP1融合蛋白均有效抑制卵巢癌細胞增殖，誘導細胞凋亡，顯著抑制卵巢癌的發生和發展，顯示了良好的應用價值和治療前景，為探索卵巢癌新的治療方法提供了理論基礎。

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