結核病疫苗研究

彭寶洲，劉梓健，粟海波

（廣州醫科大學-廣州生物醫藥與健康研究院聯合生命科學學院，廣東廣州 511436）

1 前言

1.1 結核病現狀

結核病是全球第九大死因，也是單一病原體感染造成的主要死因，高于HIV病毒，是傳染病死亡人數之首。據估計，2016年全球結核病新發病例數為1 040萬例，167.4萬例死于結核病，其中34.7萬人合并感染HIV病毒。全球約有1/4的人口有結核分枝桿菌潛伏感染（latent TB infection，LTBI）[1]。

中國是世界上結核病高負擔國家之一，結核病患者數量居世界第三。結核病是中國農村因病致貧、因病返貧的主要疾病之一，嚴重制約我國經濟和社會的發展[2]。

1.2 結核病的致病機制

結核病由結核分枝桿菌（Mycobacterium cuberculosis，Mtb）引起，Mtb已發展了許多機制來避免被吞噬細胞殺傷，特別是單核吞噬細胞。在宿主細胞內，Mtb寄居于吞噬體內且阻止吞噬體間的融合。通過ESX-1分泌系統破壞吞噬體膜，抗原可以進入胞漿，其本身也可能進入胞漿。Mtb抗原可與Ⅰ型MHC和Ⅱ型MHC結合分別被CD8+和CD4+T細胞識別，而Mtb可以下調Ⅱ型MHC的表達以減弱CD4+T細胞反應，抑制CD4+T細胞的積累[3]。

Mtb在活性階段和休眠階段的基因表達有很大的差異。活性Mtb表達復制和高代謝活性的遺傳程序，包括毒力因子的表達以幫助其入侵宿主細胞，滅活或破壞宿主的防衛機制并破壞其組織；而在休眠階段，Mtb幾乎沒有代謝、復制、毒力的基因表達[4]，由此來逃避免疫。休眠期Mtb表達的抗原被稱為休眠抗原，從更廣泛的意義上講，休眠抗原還包括營養缺乏和有效免疫控制下表達的抗原。休眠期Mtb減少了毒力表達和對宿主細胞的破壞，與此同時，它對免疫系統卻是一個難題，其持續感染健康個體，導致結核分枝桿菌潛伏感染（LTBI）。一旦宿主的免疫能力低下，Mtb即可從休眠階段復蘇返回活性階段，傳播和進入新宿主。在全球范圍內，估計有20億人擁有LTBI，且絕大多數人將終生維持這一狀態，只有約5%的LTBI患者會在感染的頭幾個月內發展成結核病，主要發生在兒童和免疫功能低下的患者特別是HIV+個體中。另外，少數的LTBI患者可維持這一狀態數年至數十年，通過再活化或再感染而發病，這些個體在免疫功能足夠強力時壓制著Mtb，在后期免疫力減弱時發病。

同時，耐多藥結核病（MDR-TB）也給全球的結核病疾病控制帶來了巨大的挑戰。2016年，全球有60萬耐利福平（最有效的一線藥物）的新病例，其中49萬為耐多藥結核病。全球數據顯示，接受治療的耐多藥結核病患者平均治愈率僅為54%。最近報道了幾乎定義為完全耐藥結核病的病例，表明人類結核病正在加入進入抗生素后時代的細菌性疾病[5]。

1.3 目前主要疫苗

卡介苗（Bacille Calmette-Guérin，BCG）是目前唯一一種用于預防兒童結核病的預防接種疫苗。相比較牛分支桿菌與Mtb，BCG缺乏了多個基因組片段。其主要減毒原因是RD1（the Region of Different 1）基因，該基因編碼免疫顯性抗原，包括ESAT-6、CFP-10以及分枝桿菌獨有的ESX-1 Ⅶ型分泌系統。

雖然BCG對結核病的預防功不可沒，還能通過刺激非特異性免疫系統來對抗常見疾病[6]，但研究表明，BCG僅對預防兒童結核病有效，而對青年和成人結核病沒有保護作用且其作用具有地域性。所以，更加安全有效的疫苗是人們的迫切需要。

近年來，一些新型結核病疫苗已進入臨床試驗的不同階段，本綜述對全球結核病疫苗進行系統簡述，包括重組卡介苗、亞單位疫苗、病毒載體疫苗、治療性疫苗等。

2 國內外結核病疫苗研究現狀

2.1 重組卡介苗

目前，卡介苗顯然不足以控制全球結核病，而重組BCG旨在代替目前的BCG疫苗[2-3]。

鋅蛋白酶由zmp1基因編碼，致病性分支桿菌依靠該蛋白短暫停止吞噬體的成熟；BCG Δ zmp1將zmp1基因移除可使更多活疫苗被運往成熟的吞噬體，增強Ⅱ型MHC受限抗原的呈遞，已進入臨床前試驗階段。

BCG Δ ureC::hly（VPM1002）將單核細胞李斯特菌hly基因整合至BCG。hly基因可編碼溶血性穿孔蛋白溶血素O能在吞噬體膜上穿孔，其最適pH為5.5。ureC基因編碼尿素酶C，尿素酶C缺失可促進吞噬體內的酸性環境，保證溶血素活性。穿孔可以使細菌的蛋白質和DNA進入宿主細胞胞漿，導致Ⅰ型MHC受限抗原呈遞增強、細胞凋亡和細胞自噬。BCG Δ ureC::hly被證實在成人中有免疫原性，甚至能用于HIV+患者，已進入臨床IIb期試驗。

此外，BCG Δ ureC::hly還有新的改進方案：BCG Δ ureC::hly Δ nuoG 和 BCG Δ ureC::hly Δ pdx1。

nuoG是BCG中的抗細胞凋亡毒力基因，編碼NADH 脫氫酶1亞基G。BCG Δ ureC::hly Δ nuoG 比BCG更安全，并且改善了對親本BCG Δ ureC::hly的保護，顯著降低了鼠肺中的TB負荷并增強了免疫應答，具有優異的療效和安全性。

pdx1是細菌和真菌的維生素B6合成基因，該基因的缺失使得維生素B6營養缺陷型Mtb顯著抑制了其在小鼠中的存活。BCG Δ ureC::hly Δ pdx1在皮下免疫小鼠中顯示明顯受限的播散，該疫苗的比親本BCG Δ ureC::hly更安全，甚至有望用于HIV+嬰兒。

BCG ::pfo（AERAS-422）疫苗加入了產氣莢膜梭菌溶血素基因，且表達了3個抗原——Ag85A、Ag85B、Rv3407，其中Rv3407是在Mtb從休眠狀態復蘇時表達的抗原。然而，該疫苗在臨床Ⅰ期試驗中存在安全性問題而被終止。

BCG ::ESX-1將ESX-1基因插入BCG中，ESX-1 T7SS是BCG減毒的主要原因，但ESX-1分泌蛋白是重要的抗原物質。這些抗原物質Mtb能產生，而BCG不能。該疫苗在臨床前試驗中表現出更強的免疫原性，但其毒性會增強。最近，有使用親緣關系更疏遠的海魚分枝桿菌的ESX-1基因來補充BCG（BCG::ESC-1Mmar），這個結構比BCG ::ESX-1Mtb更加安全有效，已進入臨床前試驗階段。

Mtb Δ phoP Δ fadD26（MTBVAC）疫 苗 來 源 于Mtb株系MT103。phoP基因編碼轉錄因子，控制分枝桿菌的胞內適應并促進ESAT-6的分泌。fadD26是脂質合成基因，與細胞壁形成、細菌毒力、胞內存活相關。該疫苗的安全性與BCG相當，且免疫原性和保護力更強，能CD4+T細胞數量。高度減毒的MTBVAC可能成為高風險免疫抑制人群的潛在疫苗，現該疫苗已進入臨床Ⅰ期試驗階段。

BCG ::AB疫苗插入了抗原Ag85A和Ag85B的基因，和BCG相比有更高的Ag85A和Ag85B蛋白過表達水平。BCG ::AB可提供更強更持久的保護作用，已進入小鼠保護實驗。

BCG ::AR疫苗包含了Ag85B和Rv3425基因，Rv3425是PPE家族亞組3的成員，在所有BCG菌株中都不存在。該疫苗接種小鼠后，增強了Th1細胞應答，提升γ干擾素水平，具有比BCG更強的保護效力。該疫苗已進入臨床前實驗階段。

BCG ::GCE是一個共表達人GM-CSF和結核桿菌特異性抗原CFP10與ESAT6的重組卡介苗，該疫苗免疫小鼠后，血清特異性抗體滴度迅速升高，脾淋巴細胞增殖、CD4+和CD8+T細胞比例及γ干擾素分泌也增加，已進入小鼠保護實驗。

2.2 亞單位疫苗

亞單位疫苗在BCG注射后使用，主要用于增強BCG誘導的免疫反應。大部分重組卡介苗的主要使用人群是兒童和青年，將重組卡介苗與亞單位疫苗結合使用，可以將他們的應用擴大到成人群體中[2,7]。

M72是PPE家族成員Rv1196（Mtb39A）和絲氨酸蛋白酶Rv0125（Mtb32A）的融合蛋白，加佐劑AS01E；M72/AS01E疫苗具有免疫原性并兼顧臨床上可接受的安全性，能誘導CD4+T細胞對M27的特異性免疫應答和體液免疫，且該疫苗對LTBI人群具有較好的安全性，已進入臨床IIb期試驗。

Hybrid 1是Ag85B和ESAT-6的融合蛋白，Hyvac 4是Ag85B與TB10.4的融合蛋白。兩種疫苗都使用佐劑IC31，且能持續有效地誘導免疫應答，均已進入臨床IIa期試驗。

Hybrid 56是利用了休眠抗原的疫苗，這個疫苗不僅包含了早期分泌抗原ESAT-6和Ag85B，而且還包含潛伏感染抗原Rv2660。Rv2660基因產物在脅迫條件下表達，被認為是休眠抗原，本身具有弱免疫原性。將Rv2660與ESAT-6、Ag85B結合后，在實驗動物模型中保護性免疫應答顯著提升，能增強BCG對獼猴抵抗Mtb感染的保護作用。該疫苗已進入臨床Ⅱ期試驗。這個疫苗代表了TB疫苗開發的一大進步，因為其包含的抗原在感染的不同階段即可識別。此外，一項H56 cDNA的臨床前內皮注射小鼠試驗中，H56 cDNA誘導了特異性CD4+T細胞應答和Ag85B IgG抗體，改善肺部病理[8]。

融合蛋白ID93包含3個毒力蛋白Rv2608、Rv3619、Rv3620和1個休眠蛋白Rv1813。ID93/GLA-SE與Hybrid 56亞單位疫苗都包含了不同感染階段的抗原。在小鼠中，ID93和佐劑GLA-SE組合使用誘導了多功能CD4+Th1細胞應答，以及隨后感染動物的肺中細菌數量減少。在豚鼠實驗中，ID93與BCG組合使用還降低了死亡率。蛋白亞單位疫苗ID93/GLA-SE可預防動物中的結核病和耐多藥結核病，并且可以提高兒童BCG疫苗的保護效力，已進入臨床Ia期試驗。

LT70疫苗將抗原ESAT-6、Ag85B、MPT64的肽190-198、Mtb8.4和潛伏期相關抗原Rv2626融合共同構建為多級蛋白LT70，LT70可被來自結核病人和LTBI患者的T細胞識別并產生免疫應答，具有更高的保護效力，已進入小鼠保護實驗。

重組結核疫苗AEC/BC02是由重組MTB抗原Ag85B、ESAT-6、CFP-10與復合佐劑BC02構成的亞單位疫苗，該疫苗免疫原性強，在豚鼠實驗中多次注射免疫后沒有觀察到明顯的Koch現象，具有較高的安全性。該疫苗有望用于LTBI患者，已進入臨床前實驗。

2.3 病毒載體疫苗

病毒載體疫苗主要以痘苗病毒、腺病毒、仙臺病毒為載體構建結核病新型疫苗，主要用于免疫加強或預防性免疫[9]。

MVA85A一種表達抗原Ag85A的改進后的安卡拉牛痘病毒，改進后的痘苗病毒雖然不能在哺乳動物細胞中復制，但能表達蛋白，誘導T細胞應答。該疫苗在多年前已接種BCG的個體中也能誘導二次免疫應答，僅觀察到輕微的不良反應，在LTBI患者中也有相似的免疫效果。但在臨床IIb期試驗中對兒童沒有表現出免疫效力，以失敗告終。

重組腺病毒載體特別適用于誘導強烈的T細胞免疫。Ad35-TBS（AERAS-402）是這一類型疫苗中較先進的一種，是基于Ad35型的病毒載體疫苗，它表達了Mtb抗原Ag85A、Ag85B和TB10.4的獨特融合蛋白。在動物模型中，通過鼻內或肌內途徑施用給小鼠賦予了針對Mtb的保護作用，能誘導CD4+和CD8+T細胞免疫應答。該疫苗已進入臨床I期試驗階段。

Ad5Ag85A是一種基于復制缺陷型黑猩猩腺病毒載體的疫苗，這個疫苗僅表達抗原Ag85A。這個疫苗通過鼻內給藥而不是肌肉注射，在臨床Ⅰ期試驗中表現出高免疫原性，能刺激多功能T細胞應答，比BCG更有效地提高了CD4+和CD8+T細胞免疫。該疫苗能提高BCG的保護效力，已進入臨床I期試驗。

Ad5-CEAB也是一種通過鼻內滴注的腺病毒載體疫苗，其表達的抗原包括CFP-10、ESAT-6、Ag85A、Ag85B。在小鼠模型中，該疫苗能導致強烈的抗原特異性免疫應答以及體液應答，已進入臨床前試驗階段。

TB/ FLU-04L是由流感病毒株A/Puetro Rico/8/34 H1N1和Mtb抗原Ag85A、ESAT6組成的重組流感疫苗。該疫苗正在計劃進行IIa期試驗。

2.4 治療性疫苗

治療性疫苗設計的主要目標是預防潛伏感染或減少化療的持續時間[2,7,10]。

M.Vaccae是通過滅活母牛分枝桿菌全細胞株開發的，其耐受性良好，沒有報道嚴重的不良反應。該疫苗具有有效的免疫原性和安全性，已進入臨床Ⅲ期試驗，目前正在中國接受針對LTBI患者的有效性和安全性試驗。

MIP是一種快速生長的非致病性腐生菌，在一項小鼠模型研究中，通過氣霧劑給藥時，MIP具有比BCG更高的免疫原性和保護效力。該疫苗已進入臨床Ⅲ期試驗。

RUTI是由脂質體遞送的解毒、半純化的Mtb細胞碎片制成的治療性疫苗，這些Mtb在脅迫和饑餓條件下培養而成，該疫苗的療效得益于Mtb在肉芽腫病變中通常表達的休眠期抗原的富集。研究顯示，RUTI在小鼠和豚鼠中顯示出控制結核感染潛伏形式的功效，在短期化療后誘導多抗原反應和抗體產生。該疫苗已進入臨床IIb期試驗。

Ag85A/B DNA是一個DNA疫苗，將Ag85A和Ag85B基因插入到質粒載體中，在Ag85A/B嵌合DNA肌肉注射小鼠免疫治療實驗中，小鼠顯示出顯著的免疫反應，對治療結核病有效。已進入臨床前實驗。

分枝桿菌obuense衍生的DAR-901是一種多抗原熱滅活全細胞疫苗，該疫苗使用肉湯培養方法制造，與Mtb共享多種抗原，因此可以提供交叉保護。DAR-901旨在成為艾滋病毒感染和未感染艾滋病毒的青少年和成人預防結核病的強化疫苗，該疫苗已進入臨床IIb期試驗。

3 結核病疫苗研究中存在的問題、對策與展望

3.1 存在的問題與對策

目前，全球的結核病疫情日益嚴峻，主要存在以下幾方面問題有，（1）不同地區BCG的特異性差異。（2）MDT-TB的出現使疫情控制困難，疫情下降緩慢或有所回升。（3）Mtb與HIV的合并感染；目前沒有十分適用于HIV+患者的疫苗，BCG也同樣不能用于HIV+患者。HIV感染使BCG失控增長和傳播，導致卡氏病的出現，因此HIV+兒童不能接種BCG。（4）Mtb與寄生蟲感染；寄生蟲感染使患者Th細胞向Th2極分化，對抗寄生蟲；而Th2細胞將下調Th1細胞，從而降低對TB的保護。（5）疫苗的人群特異性問題。（6）疫苗的評測需要更優良的模型；研究發現很多實驗的免疫結果與實際使用效果不符。

對于這些問題，可以采用的對策有：（1）對前人的臨床實驗失敗進行總結，吸取經驗教訓；（2）對不同的BCG菌株進行鑒定；（3）隨著MDR-TB的出現，未來患者的治療應考慮藥物和治療性疫苗聯合使用的手段；（4）開發針對不同人群的結核病疫苗，如HIV+患者、兒童、老年人等易感人群；（5）創建新的疫苗評估模型。

3.2 對未來的展望

未來將有越來越多的結核病候選疫苗進入臨床試驗階段，疫苗的測試需要更多的經費和更大的平臺。對于未來結核病的發展方向，應如下：（1）研制安全性和保護力強于BCG的疫苗以代替BCG；（2）采用初始免疫和增強免疫相結合的策略，如改良BCG和亞單位疫苗共用；（3）研發可針對所有年齡人群的多階段亞單位疫苗，特別是對休眠抗體的研究；（4）未來的疫苗應考慮利用BCG非特異性免疫的潛在作用。

世界衛生組織《終止結核病策略》確定的具體目標有：在2015年基礎上，到2030年將結核病死亡人數減少90%，將結核病發病率降低80%。為了實現這些目標，需要科學和社會層面的密切合作，世界各國各地區的共同努力。