5株乳酸菌復合物與CaCO3，酶及尿素不同組合對全株玉米青貯品質影響

王建福，雷趙民，萬學瑞，姜輝，李潔，吳建平*

(1.甘肅農業(yè)大學動物科學技術學院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農業(yè)大學動物醫(yī)學院，甘肅 蘭州 730070)

青貯是提高玉米(Zeamays)秸稈利用率并有效保存其營養(yǎng)價值的重要手段。在青貯發(fā)酵的微生物體系中，同質發(fā)酵乳酸菌所產生的乳酸可以使環(huán)境pH值迅速降低，從而抑制其他有氧細菌、酵母菌和霉菌的生長，減少其他有機酸的生成量，從而減少青貯營養(yǎng)損失并保證青貯品質[1]。玉米秸稈上所附著的乳酸菌數(shù)量往往不足，導致發(fā)酵后pH值下降緩慢，腐敗菌生長期延長，營養(yǎng)物質損失增加[2]。通過添加外源乳酸菌，使其在青貯發(fā)酵系統(tǒng)中形成優(yōu)勢菌群，產生大量乳酸，迅速降低pH值并抑制其他腐敗菌的生長，對保存青貯營養(yǎng)價值具有重要作用[3]。CaCO3、纖維素酶、淀粉酶和尿素在青貯中的應用均有報道：CaCO3不僅可以補充飼料中鈣含量，而且可以中和青貯中的酸，提高發(fā)酵產物的適口性[4]；淀粉酶和纖維素酶可以增加青貯發(fā)酵中的可溶性糖的濃度，為乳酸菌發(fā)酵的迅速啟動提供充足底物，以促進發(fā)酵[5]；尿素不但可以為微生物發(fā)酵提供氮源，提高發(fā)酵產物的粗蛋白含量和營養(yǎng)價值，其本身還可以直接作為反芻動物飼料中的非蛋白氮添加劑[6]。在前期的試驗中篩選出了5株具有提高青貯發(fā)酵品質并抑制二次發(fā)酵潛力的乳酸菌[7]，為了檢測其混合菌液及其與CaCO3、纖維素酶、淀粉酶和尿素等復合制劑對全株玉米青貯發(fā)酵促進和營養(yǎng)成分保存的作用過程和效果，通過檢測發(fā)酵過程中不同添加組合青貯發(fā)酵品質和營養(yǎng)品質的變化，為玉米秸稈青貯調制及乳酸菌復合制劑研制提供理論依據(jù)和技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料及設備

蠟熟期收獲的全株玉米為2016年10月由臨洮縣華加牧業(yè)有限公司提供，干物質含量約29%～33%；腸膜明串珠菌腸膜亞種(Leuconostocmesenteroidessubsp.mesenteroides)B1-7、戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)B2-3、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)B3-1、屎腸球菌(Enterococcusfaecium)B5-2、發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)E2-3均由本實驗室分離鑒定并保存, 乳酸菌用Modified Sholtens’ Broth (MSB)液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至對數(shù)生長期，調濃度為1×109cfu·mL-1，按5 mL·kg-1青貯原料添加，即5×106cfu·g-1，不添加菌液組添加等體積的MSB液體培養(yǎng)基；CaCO3和尿素為分析純試劑；纖維素酶酶活20000 U·g-1，α-淀粉酶酶活3700 U·g-1；秸稈粉碎機(9Z-9A型青貯鍘草對輥揉搓型)由洛陽四達農機有限公司生產；相關儀器還包括聚乙烯真空包裝袋(22 cm×28 cm)及真空包裝機；相關發(fā)酵品質及營養(yǎng)成分檢測設備由甘肅農業(yè)大學動物科學技術學院實驗室提供。

1.2 試驗設計

試驗共設置8個組，其中1個空白對照組(CK)，1個復合乳酸菌對照組(B)，6個處理組(Bca、BU、BCA、BCaCA、BCAU、BCaCAU)，見表1。每組設置3個重復，每袋裝樣量為0.5 kg，真空包裝后室溫保存。

表1 試驗設計Table 1 The design of experiment

1.3 測定方法

按常規(guī)法[8]測定青貯飼料的干物質(dry matter，DM)、粗蛋白(crude protein，CP)和粗脂肪(ether extract，EE)含量； 采用Van Soest等[9]的方法測定酸性洗滌纖維(acid detergent fiber，ADF)和中性洗滌纖維(neutral detergent fiber，NDF)；按照Dubois等[10]的方法測定水溶性碳水化合物(water soluble carbohydrate，WSC)含量；液相色譜法(Waters ACQUITY UPLC，色譜柱BEH C18 1.0 mm×50 mm, 1.7 μm，流動相為水和0.3%磷酸甲醇，流速為0.1 mL·min-1，檢測波長210 nm，進樣量5 μL)測定青貯中的乳酸(lactic acid，LA)和乙酸(acetic acid，AA)；苯酚-次氯酸鈉比色法[11]測定NH3-N；取青貯樣品20 g，加入180 mL蒸餾水，攪拌均勻，組織搗碎機均勻搗碎后紗布過濾，pH計測定濾液pH值。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

利用Excel軟件進行數(shù)據(jù)整理，SPSS Statistic 19.0軟件包進行單因素ANOVA方差分析和Duncan氏多重比較，試驗結果采用平均值±標準差表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵前玉米秸稈營養(yǎng)成分

青貯前全株玉米粉碎后的DM含量為28.86%，CP含量為7.73%，EE含量為3.47%，WSC含量為14.92%，NDF含量為52.17%，ADF含量為26.13%。原料的可溶性糖類含量和含水量符合青貯飼料調制要求。

2.2 全株玉米青貯發(fā)酵不同時期產物品質

全株玉米青貯發(fā)酵不同時期產物品質如表2所示。發(fā)酵3 d，BCAU組LA含量最高，顯著高于除BCaCA組和BCaCAU組外的其他各組(P<0.05)，B組含量最低；BCa組AA含量最高，顯著高于其他各組(P<0.05)，B組含量最低；B組LA/AA最高，BCa組最低，但差異不顯著(P>0.05)；BCaCA組氨態(tài)氮含量最低，顯著低于除CK和B組之外的其他各組(P<0.05)，BU組含量最高；B組pH值顯著低于其他各組(P<0.05)，BCa組和BCaCA組pH值較高，顯著高于其他各組(P<0.05)。

發(fā)酵10 d，BCAU組LA含量最高，顯著高于除BCaCAU組外的其他各組(P<0.05)，CK組含量最低；CK組AA含量最低，顯著低于除B組之外的其他各組(P<0.05)，BCa組含量最高；CK組LA/AA最高，BCa組最低，但差異不顯著(P>0.05)；BCaCA組氨態(tài)氮含量最低，顯著低于除CK組和BCa組外的其他各組(P<0.05)，BCAU組氨態(tài)氮含量最高；CK組pH值最低，顯著低于其他各組(P<0.05)，BCaCA組最高。

發(fā)酵30 d，BCa、BCaCA、BCAU和BCaCAU組LA含量均較高，顯著高于其他各組(P<0.05)，CK組最低；CK組AA含量最低，顯著低于除B組和BCA組外的其他各組(P<0.05)，BCaCAU組含量最高；BCaCA組和BCAU組LA/AA最高，BU組最低，但差異不顯著(P>0.05)；B組氨態(tài)氮含量最低，顯著低于BU組、BCAU組和BCaCAU組(P<0.05)，BU組含量最高；B組pH值最低，顯著低于除CK組之外的其他各組(P<0.05)，BCaCA組最高。

2.3 全株玉米青貯發(fā)酵不同時期產物化學成分

全株玉米青貯發(fā)酵不同時期產物化學成分如表3所示。發(fā)酵3 d，BU組CP含量最高，顯著高于除BCaCAU組的其他各組(P<0.05)，BCaCA組含量最低；BCaCA組EE含量最高，顯著高于除BCa組外的其他各組(P<0.05)，BCaCAU組含量最低；B組ADF含量最低，顯著低于除CK、BU和BCA組之外的其他各組(P<0.05)，BCa組含量最高；B組NDF含量最低，顯著低于除CK、BU、BCA和BCaCA組之外的其他各組(P<0.05)，BCAU組含量最高；BCA組的WSC含量最高，顯著高于除CK、B、BCAU和BCaCAU組外的其他各組(P<0.05)，BU組含量最低。

發(fā)酵10 d，BCaCAU組的CP含量最高，顯著高于除BCAU組外的其他各組(P<0.05)，BCaCA組含量最低；BCaCA組EE含量最高，顯著高于除BCa組之外的其他各組(P<0.05)，BCAU組含量最低；ADF和NDF各組均無顯著差異(P>0.05)；BCA組WSC含量最高，顯著高于除CK組和B組之外的其他各組(P<0.05)，BCaCAU組含量最低。

表2 不同添加物對全株玉米青貯發(fā)酵不同時間產物品質變化影響Table 2 Fermentation quality of corn silage in different time with different inoculant

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同或無字母表示差異不顯著(P>0.05)，下同。

Note: The different lowercase letters in the same column mean significant differences atP<0.05, the same or no letter mean no significant differences atP>0.05. The same below.

發(fā)酵30 d，BCaCAU組CP含量最高，顯著高于除BU組之外的其他各組(P<0.05)，CK組含量最低；BCaCA組EE含量最高，顯著高于除BCa、BCA和BCAU組外的其他各組(P<0.05)，BU組含量最低；B組ADF含量最低，但除顯著低于BCaCAU組之外(P<0.05)，與其他各組差異均不顯著(P>0.05)；各組NDF差異均不顯著(P>0.05)；CK組WSC含量最高，顯著高于除B和BCA組外的其他各組(P<0.05)，BCAU組含量最低。

3 討論

3.1 復合乳酸菌對全株玉米青貯發(fā)酵品質和營養(yǎng)品質變化的影響

乳酸菌可以分為同質發(fā)酵乳酸菌和異質發(fā)酵乳酸菌，同質發(fā)酵往往僅產生乳酸，青貯的品質較高，營養(yǎng)成分損失較少[12]，但青貯取用后的有氧穩(wěn)定性往往較差，在實際生產中使用并不理想。異質發(fā)酵過程除了產生乳酸之外，還產生乙酸、甘露醇甚至乙醇等物質，發(fā)酵過程的營養(yǎng)和能量損失往往較大，但乙酸等可以抑制有害菌的生長， 使取用后的青貯有氧穩(wěn)定性增強[13]。所以，在青貯實際使用的乳酸菌制劑中，往往既有同質發(fā)酵乳酸菌也有異質發(fā)酵乳酸菌，并添加其他青貯促進或不利發(fā)酵抑制物質。本試驗所使用的5株乳酸菌中，戊糖片球菌B2-3、植物乳桿菌B3-1和屎腸球菌B5-2屬于同質發(fā)酵乳酸菌，腸膜明串珠菌腸膜亞種B1-7和發(fā)酵乳桿菌E2-3屬于異質發(fā)酵乳酸菌。從5株菌復合物的添加效果來看，其提高了30 d發(fā)酵LA和AA的產量以及LA/AA比例，降低了氨態(tài)氮和pH值，提高了30 d發(fā)酵產物的CP、EE，降低了ADF和NDF含量，提高了全株玉米青貯的發(fā)酵品質和營養(yǎng)品質。但從時間上來看，發(fā)酵過程中的發(fā)酵品質和營養(yǎng)品質變化是復雜的，趨勢并不完全一致，所以，還需要對發(fā)酵過程中微生物種類和數(shù)量的變化及其發(fā)酵的底物和產物進行綜合分析來揭示復合添加物對發(fā)酵品質變化的影響機制。

表3 不同添加物對全株玉米青貯發(fā)酵不同時間產物化學成分變化的影響Table 3 Chemical composition of corn silage in different time with different inoculant (%DM)

3.2 復合乳酸菌和CaCO3復合添加對玉米秸稈青貯發(fā)酵品質和營養(yǎng)品質變化的影響

從本試驗結果可見，CaCO3的添加提高了青貯過程中的LA和AA的產量，可以提高青貯產物中的總酸產量，其中對AA的增加作用較大，降低了LA/AA比例，提高了發(fā)酵的pH值以及氨態(tài)氮的含量。隨著發(fā)酵時間的延長，CaCO3除了能進一步顯著提高LA和AA產量外，還可以提高LA/AA的比例，從而提高青貯發(fā)酵品質。在30 d發(fā)酵后，CaCO3與乳酸菌復合添加組LA含量相比單獨的復合乳酸菌添加組及空白對照組分別提高了26%和30%；AA含量相比單獨的復合乳酸菌添加組和空白對照組分別提高了35%和37%。AA對真菌具有較好的抑制作用，所以AA含量的提高對提高青貯產物的有氧穩(wěn)定性是有利的。Pejin等[14]在啤酒糟的發(fā)酵過程中添加CaCO3分別使添加發(fā)酵乳桿菌和鼠李糖乳桿菌發(fā)酵組LA產量增加了13%和17%。Li等[15]發(fā)現(xiàn)在玉米青貯中添加CaCO3能夠快速的產生LA，發(fā)酵3 d的LA產量已經(jīng)比對照組高出3倍，同時也提高了AA的產量。本試驗中發(fā)酵3 d添加CaCO3組也獲得了較高的LA產量，但AA產量增幅更大。

郭天龍等[16]發(fā)現(xiàn)在甜菜(Betavulgaris)青貯發(fā)酵中添加CaCO3可使WSC含量降低，而對其他營養(yǎng)成分含量無影響，而本試驗發(fā)現(xiàn)，CaCO3的添加提高了玉米秸稈青貯的CP和EE含量，有提高ADF和NDF的趨勢，降低了WSC的含量。可能是因為與單獨添加復合乳酸菌相比，添加CaCO3進一步促進了復合乳酸菌以及其他菌類的發(fā)酵，利用了發(fā)酵底物WSC，增加了微生物的含量所致。Santos等[17]在甘蔗(Saccharumofficinarum)青貯試驗中也發(fā)現(xiàn)添加復合乳酸菌不能使青貯營養(yǎng)成分含量提高，但是添加CaCO3提高了發(fā)酵產物的營養(yǎng)價值。本試驗中，復合乳酸菌和CaCO3復合添加對進一步促進青貯發(fā)酵具有顯著效果，并且隨著發(fā)酵時間的延長，EE、ADF、NDF有增加的趨勢，WSC有降低的趨勢。

3.3 復合乳酸菌和尿素復合添加對玉米秸稈青貯發(fā)酵品質和營養(yǎng)品質變化的影響

尿素作為一種含氮物質，在玉米青貯過程中可以顯著提高CP含量，彌補玉米秸稈本身蛋白含量的不足[18]。但也有研究認為，青貯中添加尿素會使LA/AA比例降低，氨態(tài)氮含量增加，降低青貯發(fā)酵品質[19]。本研究中，復合乳酸菌和尿素的復合添加提高了青貯料氨態(tài)氮的含量及pH值，LA/AA比例下降，但LA和AA的含量均高于空白對照組和復合乳酸菌單獨添加組，尤其是AA含量的增加明顯。發(fā)酵產物中增加的氨態(tài)氮含量主要由添加的尿素產生，反芻動物瘤胃中本身也可以利用這種非蛋白氮，而且尿素作為氮源，促進了青貯過程中發(fā)酵菌的生長，進一步提高了蛋白含量，發(fā)酵產生的乙酸具有抑制霉菌等有害菌的作用，有利于提高發(fā)酵產物的有氧穩(wěn)定性，降低青貯取用后的二次發(fā)酵損失[20]。

3.4 復合乳酸菌和纖維素酶、淀粉酶復合添加對全株玉米青貯發(fā)酵品質和營養(yǎng)品質變化的影響

纖維素酶和淀粉酶可以分解秸稈中的纖維素和淀粉，為青貯發(fā)酵提供更多的可溶性糖類底物，從而促進青貯發(fā)酵過程，尤其是當發(fā)酵底物中的WSC含量不足時，這種作用更加顯著[21]。本研究發(fā)現(xiàn)在全株玉米青貯中添加復合乳酸菌和兩種酶制劑在發(fā)酵3 d時，可以顯著提高LA和AA的產量，但隨著發(fā)酵時間的延長，這種作用變弱，并且與對照組和復合乳酸菌單獨添加組差異變得不顯著。隨著發(fā)酵時間的延長，纖維素酶和淀粉酶的添加可以進一步增加AA產量，降低LA/AA比例，更有利于提高青貯發(fā)酵產物的有氧穩(wěn)定性。纖維素酶和淀粉酶與復合乳酸菌的復合添加沒有使全株玉米青貯發(fā)酵過程中的營養(yǎng)品質有所改善，CP、EE、ADF、NDF以及WSC與對照組和復合乳酸菌單獨添加組相比差異均不顯著。但與添加CaCO3和復合乳酸菌組以及尿素和復合乳酸菌組相比，顯著提高了發(fā)酵產物的WSC含量，進一步體現(xiàn)了多種添加劑組合可能對乳酸菌發(fā)酵的促進作用。但是可能由于全株玉米青貯原料的可溶性糖類含量豐富，兩種酶對可溶性糖類的增加作用有限[22-23]。

3.5 復合乳酸菌、CaCO3、尿素與纖維素酶和淀粉酶的復合添加對全株玉米青貯發(fā)酵品質和營養(yǎng)品質變化的影響

復合乳酸菌、CaCO3和兩種酶的復合添加可以增加全株玉米青貯發(fā)酵的LA和AA產量，提高EE含量和pH值，降低WSC含量，并且在所測定的時間內這種趨勢是持續(xù)的。可見，同時添加復合乳酸菌、CaCO3和兩種酶有利于促進青貯發(fā)酵，提高全株玉米青貯的發(fā)酵品質和營養(yǎng)品質，也有利于改善發(fā)酵產物的適口性[24]。復合乳酸菌、兩種酶和尿素的復合添加可以增加全株玉米青貯發(fā)酵的LA和AA產量，提高發(fā)酵產物的氨態(tài)氮含量、pH值和CP含量，降低WSC含量，在所測定的時間內LA和AA產量、pH值及WSC含量的變化趨勢是持續(xù)的，氨態(tài)氮和CP含量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。可見，同時添加復合乳酸菌、兩種酶和尿素有利于促進青貯發(fā)酵，提高全株玉米青貯的發(fā)酵品質和營養(yǎng)品質，尤其是可以顯著提高發(fā)酵產物的CP含量，也有利于改善發(fā)酵產物的適口性。復合乳酸菌、CaCO3、兩種酶和尿素的復合添加可以增加全株玉米青貯發(fā)酵的LA和AA產量，提高發(fā)酵產物的氨態(tài)氮含量、pH值和CP含量，降低WSC含量，在所測定的時間內LA和AA產量、氨態(tài)氮含量、pH值及CP含量的變化趨勢是持續(xù)的，WSC含量呈現(xiàn)先降低后增加的趨勢。可見，同時添加復合乳酸菌、CaCO3、兩種酶和尿素有利于促進青貯發(fā)酵，提高全株玉米青貯的發(fā)酵品質和營養(yǎng)品質，也有利于改善發(fā)酵產物的適口性。同時添加CaCO3、尿素和兩種酶組CP隨著發(fā)酵時間的延長逐漸增加，而EE、ADF、NDF和WSC均表現(xiàn)出了先降低后增加的趨勢，可見微生物發(fā)酵在3～30 d期間活躍且復雜[25]，而相關的機理尚需進一步通過研究不同微生物組成及產物和底物變化的特點來闡明。綜合比較，同時添加復合乳酸菌、CaCO3、兩種酶和尿素組30 d后發(fā)酵產物的發(fā)酵品質和營養(yǎng)品質最好。

4 結論

5株乳酸菌混合劑的添加可以提高全株玉米青貯發(fā)酵的發(fā)酵品質和營養(yǎng)品質；同時添加CaCO3和復合乳酸菌能進一步增加青貯的LA和AA產量，尤其是AA產量，防止pH值過分降低，也有提高青貯營養(yǎng)品質的趨勢；同時添加尿素和復合乳酸菌能進一步提高青貯的AA和氨態(tài)氮的含量，防止pH值過分降低，顯著提高CP含量，從而提高青貯營養(yǎng)品質；纖維素酶和淀粉酶可以提高發(fā)酵產物的WSC含量，提高LA和AA的產量，提高青貯發(fā)酵品質；CaCO3、尿素、纖維素酶、淀粉酶和復合乳酸菌的添加對全株玉米青貯的發(fā)酵品質和營養(yǎng)品質的提高效果最好；全株玉米青貯發(fā)酵品質和營養(yǎng)品質在前3 d變化最快，發(fā)酵不同階段不同添加組合的變化不盡一致。

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