基于轉錄組數據庫的高羊茅HD-Zip I轉錄因子的鑒定及表達模式解析

莊黎麗，王劍，楊志民

(南京農業大學草業學院，江蘇 南京 210095)

在干旱、高溫、低溫或高鹽等這些逆境非生物脅迫條件下，植物中很多脅迫響應基因的轉錄水平發生了改變。一些轉錄因子在非生物脅迫響應過程中起重要作用，是稱之為調節子的轉錄調控網絡的主要組分，調控植物下游靶標基因的表達[1-2]。這些轉錄因子是對植物品種性狀進行改良，提高其逆境脅迫下抗性的潛在工具[3-4]。例如，研究表明，過量表達脫水響應元件結合蛋白(dehydration-responsive element binding，DREBs)，脫落酸響應元件結合蛋白(ABA responsive element binding factors, AREBs)和NAM, ATAF1/2, CUC2 (NACs)等轉錄因子能夠產生抗逆性增強的轉基因株系，且不影響產量[1-2]。然而，目前大部分轉錄因子參與非生物脅迫的功能研究仍然缺乏。

I類同源異型-亮氨酸拉鏈蛋白(class I homeodomain-leucine zipper, HD-Zip I)屬于高等植物所特有的HD-Zip家族的一個亞類，其序列包括一個高度保守的同源異型結構域(homeodomian, HD)及一個位于HD下游的亮氨酸拉鏈(leucine zipper, LZ)結構域[5]。在模式植物擬南芥(Arabidopsisthaliana)和水稻(Oryzasativa)中分別有17和14個成員[5-8]。根據系統進化樹，可劃分為8個進化分枝[9-10]。HD-Zip I主要參與植物對生物和非生物等逆境脅迫因子的應答反應、激素和光信號應答以及器官發育調控等過程[11]。例如，擬南芥HD-Zip I因子HB6為蛋白磷酸酶ABA-insensitive(ABI)的靶標，調控脫落酸(ABA)信號響應[12]，而HB7和HB12響應脫落酸信號，調控水分缺失條件下的植物生長[13]。月季(Rosachinensis)RhHB1參與ABA和乙烯對赤霉素氧化酶基因(RhGA20ox1)的抑制[14]。水稻中，HD-Zip I因子OsHOX12抑制赤霉素合成，調控水稻節間的伸長[15]；OsHOX4則通過影響赤霉素的信號轉導途徑來調控植株高矮及分蘗數[16-17]，而OsHOX22和OsHOX24調控水稻的耐旱性及耐鹽性[18-19]。玉米(Zeamays)中HD-ZipI基因家族的成員Grassytillers1(GT1)抑制分蘗芽的伸長[20]。大麥(Hordeumvulgare)中Six-rowedspike1 (VRS1)則調控花序的分枝發育[21]。擬南芥中3個GT1同源基因(HB21，HB40及HB53)促進脫落酸的合成，從而抑制遮陰條件下腋芽的伸長[22]。然而，即使在模式植物水稻、擬南芥中，目前對于HD-Zip I的功能研究主要集中在δ和γ進化枝，其他分枝的較少涉及，而對于非模式植物中HD-Zip I的功能，研究更少。

高羊茅(Festucaarundinacea)為禾本科羊茅屬多年生草本植物，是優良的冷季型草種，具有生長迅速、再生性強、耐濕耐熱、耐瘠薄、抗病、適應性廣等特點，在氣候過渡地帶城市綠化及人工草地建植中廣泛應用[23-26]。然而，在高羊茅的整個生命周期中，經常遭遇極端高溫、寒冷、干旱等逆境脅迫，制約高羊茅的生長發育，造成綠地景觀效果變差或草地生產力下降。因此，培育抗旱耐極端溫度的品種，有助于提高高羊茅的抗逆能力。隨著分子生物學的飛速發展，轉基因育種因其準確、直接、高效的優勢，將成為重要的生物育種手段[27-28]。優異的基因資源則為轉基因育種提供分子基礎。然而長期以來，對于高羊茅等草類植物的研究多集中在種質資源收集及生理評價，對分子機理的研究比較缺乏。這主要是由于高羊茅缺乏全基因組參考序列導致的。高通量轉錄組測序技術的出現，為高羊茅等無參考序列物種的分子生物學研究提供了豐富的轉錄組數據庫[29-31]。目前已有多個物種通過分析轉錄組數據庫得到了較為理想的轉錄因子家族序列的信息，如菊花(Dendranthemamorifolium)和茶樹(Camelliasinensis)中SBP-like、DOF、Trihelix和NAC轉錄因子家族的分析及鑒定[32-35]。這說明非模式植物中基于轉錄組數據庫分析和鑒定重要的轉錄因子家族成為可能。基于此，本研究擬在高羊茅轉錄組數據庫的基礎上，分析和鑒定高羊茅HD-Zip I轉錄因子家族，并對其結構特征及干旱脅迫下的表達模式進行分析，以期為研究高羊茅中轉錄因子家族的功能提供一種新的思路和前期基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料與生長條件

本研究選擇經典的高羊茅品種‘Kentucky-31’(K-31)為研究材料。2017年1月，將K-31種子放置在鋪兩層濾紙的培養皿中，加入適量自來水，放置于4 ℃冰箱春化3 d，隨后將培養皿置于光照培養箱萌發。將萌發10 d的小苗轉移到人工氣候室進行水培培養，一共培養9桶材料。培養條件為：白天、夜晚各12 h，白天溫度25 ℃，夜晚溫度20 ℃，濕度70%，光照強度為500 μmol·m-2·s-1。將小苗根頸部位以海綿包裹，種植于打孔的黑色泡沫板上，根系浸入1/2霍格蘭營養液[36]，并且用增氧泵通氣。每隔3 d監測一次營養液pH值，每周換一次營養液。

1.2 植物處理

2017年2月，對1/2霍格蘭營養液中水培培養的K-31植株進行模擬干旱處理，具體方法為:將聚乙二醇6000(polyethylene glycol, PEG6000)加入營養液中使其終濃度達到20%。短期干旱處理持續24 h，在20% PEG6000處理0, 3, 6, 12, 24 h時進行取樣。長期干旱在20% PEG6000處理7及14 d時取樣。取樣時，采取根頸在液氮中速凍，隨后保存在-70 ℃冰箱中。每個時間點都選取處理植株及相應的對照植株。對照組、短期干旱處理及長期干旱處理分別處理3桶植株，取樣時均有3個生物學重復。

1.3 全長高羊茅HD-Zip I (FaHD-Zip I) cDNA的數據庫搜索、克隆與測序

擬南芥HD-Zip I序列從http://www.arabidopsis.org/下載獲得。水稻HD-Zip I序列根據Agalou等[37]提供的登錄號，到NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)獲得。將3個已發表[29-31]及本實驗室兩個未發表的高羊茅轉錄組數據庫配置到BioEdit軟件的本地數據庫中。以14個水稻HD-Zip I蛋白序列作為鑒定FaHD-Zip I的請求序列，采用‘tblastn’程序，選取E-10作為期望值，搜索本地高羊茅數據庫。所得序列到NCBI進一步進行blastX搜索比對，并且進行拼接組裝，獲得候選FaHD-Zip I序列。根據預測cDNA的5′和3′端序列設計第1輪引物，根據開放閱讀框(open reading frame, ORF)設計第2輪引物。采用巢式PCR技術，通過Takara LA taq擴增FaHD-Zip I的候選目的條帶。將擴增條帶利用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒(Axygen)純化后，連接到pMD19-T，轉化大腸桿菌DH5α，經菌落PCR驗證陽性克隆后送上海生工測序。

1.4 系統進化樹的構建及序列分析

采用MEGA 6.0軟件，用鄰接法構建系統進化樹。采用Compute pI/Mw在線工具預測高羊茅HD-Zip I蛋白的等電點(isoelectric point, pI)及分子量(molecular weight, Mw)，采用PSORT預測亞細胞定位，采用MEME program v4.10.2預測保守結構域。MEME鑒定的所有結構域均在SMART和Pfam數據庫中進行搜索。

1.5 熒光定量PCR (qRT-PCR)

采用植物RNA提取試劑盒提取樣品總RNA。取1 μg RNA進行第一鏈cDNA的合成，所用試劑盒為PrimerScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)，反轉錄之前去除基因組DNA。所用定量PCR試劑為SYBR Green I Master reaction system。定量PCR的條件設置為：95 ℃預變性10 min，隨后進行40個循環的PCR擴增(95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸20 s)。每個循環都設定在65 ℃采集數據。內參基因為FaTublin[38]，每個生物學樣品都進行3次技術重復，采用2-ΔΔCT法計算基因的相對表達水平。

1.6 數據分析

采用SPSS 19.0 (SPSS Inc, Chicago, IL, USA)軟件進行方差分析并用SigmaPlot 12.5 (Systat Software, Inc, San Jose, CA, USA)繪圖，平均值采用最小顯著差異法(LSD)進行多重比較，顯著水平為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 高羊茅HD-Zip I轉錄因子的鑒定及系統進化分析

采用14個水稻HD-Zip I蛋白序列(表1)作為搜索請求，在高羊茅本地轉錄組數據庫進行搜索，經分析、組裝和拼接，巢式PCR擴增(引物序列見表2)，單克隆測序鑒定，得到13個高羊茅HD-Zip I全長ORF序列(表1)。基于水稻的名稱(OsHOX)來命名高羊茅HD-Zip I序列(FaHOXs)，并且將其登錄到NCBI (GenBank登錄號: MG189709～MG189721)。結果表明，13個FaHOX候選蛋白序列長度從221(FaHOX24)到345(FaHOX16)個氨基酸，等電點為4.66(FaHOX16)到6.32(FaHOX14)，分子質量從24604.12(FaHOX24)到37611.29(FaHOX16)。亞細胞定位預測結果表明，這13個FaHOX基因均定位在細胞核中，與其轉錄因子功能相吻合。

表1 FaHD-Zip I候選基因及其水稻同源序列概況Table 1 Summary of FaHD-Zip I sequence and the identity of likely O. sativa homologs

為了評價高羊茅、水稻及擬南芥中HD-Zip I蛋白的系統進化關系，對所得高羊茅的氨基酸序列與水稻及擬南芥中蛋白進行對比分析。采用鄰接法及靴值分析(1000次重復)構建系統進化樹(圖1)。結果表明，植物HD-Zip I家族蛋白表現出極大的多樣性，可以分為8個進化分枝，13個FaHOX蛋白及14個OsHOX蛋白均分布在α、β1、δ、γ、ζ這5個進化枝，而雙子葉植物擬南芥除了沒有蛋白在ζ進化枝分布，其他7個進化枝均有分布。其中，β2、ε及φ1為雙子葉植物擬南芥特有。此外，從進化樹可以看出，所有13個FaHOX蛋白均與相應的水稻蛋白聚類在一起，表明其親緣關系非常接近。此外，高羊茅中未找到OsHOX23的同源蛋白(表1，圖1)。

2.2 FaHD-Zip I蛋白的保守結構域分析

采用MEME軟件預測高羊茅及水稻HOX蛋白的保守結構域，一共鑒定到5個保守的結構域[結構域寬度設置為6～50個氨基酸殘基，E值(expectation value,期望值)小于1.8×10-45]，詳細信息見表3。結果表明，基于保守的氨基酸結構域，可將高羊茅HOX基因劃分為5個亞類。結構域1, 2, 3和4在FaHOX13, FaHOX8, FaHOX20和FaHOX4中同時出現，且排布方式一致。結構域1, 2, 3在FaHOX6, FaHOX24和FaHOX22中排布方式一致。FaHOX12和FaHOX14均只有1和2兩個結構域。FaHOX21與其他蛋白明顯不同，含有最多數量的結構域，單獨成為一個亞族。其他HOX蛋白，如FaHOX25, FaHOX5以及FaHOX16，以結構域5開頭，不同于其他亞族蛋白均是結構域1在N端。此外，結果還表明，除了β1亞族的FaHOX5/OsHOX5，高羊茅中比水稻中多一個結構域4，大部分高羊茅HOX蛋白與水稻HOX蛋白在結構域的排布方式及數量上有很好的一致性(圖2)。

表2 FaHD-Zip I基因克隆用引物Table 2 Primers used for FaHD-Zip I cloning

2.3 短期干旱脅迫下FaHD-Zip I基因的表達

干旱脅迫是目前影響植物生長最大的逆境條件之一，研究植物中耐旱因子有著重要的意義。采用qRT-PCR技術對20% PEG6000模擬干旱處理下高羊茅根頸中HD-ZipI基因的表達進行分析。首先設計定量PCR引物(表4)，產物長度108～197 bp。PCR擴增目的條帶，進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，FaHOX20及FaHOX21均未擴出預期條帶。對其余11個基因進行qRT-PCR檢測，結果表明，FaHOX4和FaHOX6的mRNA表達水平在短期24 h內均不受干旱脅迫影響。FaHOX5,FaHOX8,FaHOX14在處理24 h略微上調表達， 而FaHOX25在干旱處理24 h時下調表達。FaHOX12,FaHOX13,FaHOX16,FaHOX22,FaHOX24對干旱脅迫的響應比較快，處理3 h其表達水平均發生顯著的上調或者下調。其中，FaHOX22的表達水平受到干旱脅迫的影響最大，干旱處理6 h時，其表達水平上升了約14倍(圖3)。此外，從圖3可以看到，幾乎所有FaHOX基因在24 h內其本身的表達也發生變化，這說明其表達量可能受到晝夜節律的影響。

表3 高羊茅HD-Zip I家族蛋白主要MEME結構域Table 3 Major MEME motif sequences in tall fescue HD-Zip I protein

圖1 高羊茅、水稻及擬南芥HD-Zip I全長氨基酸序列的系統進化樹分析Fig.1 Phylogenetic tree analysis of full length amino acids of HD-Zip I in tall fescue, rice and arabidopsis

圖2 高羊茅與水稻中HD-Zip I蛋白的保守結構域分析Fig.2 Distribution of conserved motifs for the tall fescue and rice HD-Zip I proteins

基因名稱Genename正向引物Forwardprimer(5′-3′)反向引物Reverseprimer(5′-3′)產物長度Productlength(bp)FaHOX4AAGCTGGAGGAGGACGAGAGTGTCTCTACCAGGCCTCAT130FaHOX5CGAAGGGTGCAGTTTCCACAGGACGCAGAAAGGATGGAG184FaHOX6CAGAGTACCACCACCACCAGAAGCTTTGCAGATTGTGGCA195FaHOX8TCTTTGTACCACGGATCGCAGGATGCATGGTGGACAACAA193FaHOX12GCTACTTGATGGACTTGGCGCCCATGACACTACCACCAGT185FaHOX13AGCACGTCTCCAACCTCAATACTGTAGTACGCCCTGTCG126FaHOX14CGATGACCTGATGATGTGCGTTGAACACGCACACCTTCAG195FaHOX16GGTGGATGTGGAACTAGGCTGCGATCGATCCCAACATGAC137FaHOX20GTGTTCTTCCACGGGCATCTGCTACCTCAGTTCAGTGCA169FaHOX21CCTCCTCCGTCCCAAAGATGCAAGCCGCGACCATACATG197FaHOX22CTATCGAGTGGAATGCGGTGCGCCTCCTATCTTACACGGA161FaHOX24GTGGTAGCGTGAATCAGCGCGATGTGATCTCCGGAGTCA108FaHOX25GTGGTTCTGGAGCTGATCGACCAGTCAGAGTCGGGTAGTC111

圖3 短期干旱脅迫下FaHD-Zip I的qPCR分析Fig.3 PCR analysis of relative expression level of FaHD-Zip I under 24 h PEG6000 treatment 所有基因的相對表達量都以0 h對照植株根頸中基因表達量為1。柱子上部*表示相應時間點PEG6000處理與對照植株中基因表達量差異顯著(P<0.05)，下同。Gene expression level of control plants at 0 h was designated as 1. Stars (*) on the top of the bars indicated significant difference between the control and PEG6000-treated plants at a certain time point (P<0.05). The same below.

2.4 長期干旱脅迫下FaHD-Zip I基因的表達

進一步通過qPCR技術檢測長期干旱脅迫下FaHD-ZipI的表達水平。結果表明，干旱處理7 d時，FaHOX4和FaHOX5的表達水平均顯著低于對照，FaHOX8,FaHOX12,FaHOX13,FaHOX22及FaHOX25均顯著上調，其他幾個基因(FaHOX6,FaHOX14,FaHOX16及FaHOX24)的表達水平則不受影響。干旱處理14 d時，FaHOX6,FaHOX8,FaHOX14,FaHOX16,FaHOX22,FaHOX24及FaHOX25的表達水平均顯著高于對照植株，而FaHOX4,FaHOX5,FaHOX12及FaHOX13的表達水平則與對照無顯著差異(圖4)。其中，干旱處理14 d時，FaHOX22的表達水平比對照上調76.3倍，比其他基因的響應更為明顯。

3 討論

3.1 轉錄組數據庫可成為非模式植物進行分子生物學研究的有力工具

長期以來，參考基因組序列的缺乏極大地限制了非模式植物中進行分子生物學研究的步伐。高通量測序技術的出現，極大地豐富了非模式植物的轉錄譜信息。這不僅能夠從組學水平上對特定發育時期特定器官和組織中轉錄發生變化的基因水平進行一個評估，同時也為分子生物學研究提供了大量的序列信息。目前已有多個基于轉錄組數據庫對非模式植物某一類基因進行克隆與分析的研究[32-35]。本研究通過搜集他人已發表的高羊茅轉錄組數據庫[29-31]，整合自己的轉錄組數據庫信息，結合序列搜索、比對分析、拼接組裝及后期PCR克隆等步驟，較為快速地獲得13個高羊茅HD-Zip I轉錄因子全長序列。這說明在物種轉錄組信息豐富的情況下，采取這種方式能夠為非模式植物中基因的克隆提供很好的平臺，為后續進行這些基因的功能研究打下了基礎。

3.2 高羊茅中HD-Zip I轉錄因子的分析

目前已在不同物種中克隆了多個HD-Zip I因子并且對其功能進行了研究。本研究中，共獲得13個高羊茅HD-Zip I因子，比水稻中少1個。這一方面可能是由于其物種特異性，另外一方面也可能是由于轉錄組數據庫還沒有足夠豐富造成的。其他物種，如番茄(Solanumlycopersicum)中有22個HD-Zip I蛋白[9]，柑橘(Citrussinensis)中16個[39]，桃(Prunuspersica)中14個[40]，大豆(Glycinemax)中30個[10]。由于高羊茅為異源六倍體，會存在同一個基因多個拷貝的情況，因此其實際的HD-Zip I蛋白數目必然遠超過13個。這13個HD-Zip I蛋白均包括保守的同源異形盒及亮氨酸拉鏈結構域，且生物信息學預測均定位于細胞核，這與其轉錄因子的特性也是吻合的。系統進化樹表明13個高羊茅HD-Zip I蛋白，14個水稻HD-Zip I蛋白及17個擬南芥HD-Zip I蛋白可以分為8個進化枝，高羊茅與水稻中對應的HD-Zip I蛋白序列更為接近，且與水稻的相應蛋白共同分布在5個進化枝，與擬南芥的有較大差異，這說明HD-Zip I蛋白在單雙子葉植物中有明顯的差異。

HD-Zip轉錄因子家族分為I～IV亞類，其中，I類的結構最簡單[5]。本研究通過MEME軟件分析13個高羊茅HD-Zip I蛋白的保守結構域，共發現5個結構域。高羊茅和水稻中對應蛋白在結構域數目及排布順序方面幾乎一致，且與系統進化樹結果也比較吻合，也劃分為5個亞類。這些結果說明高羊茅HD-Zip I蛋白的功能可能也與水稻的同源蛋白比較一致。同時，FaHOX5比OsHOX5多一個結構域，說明兩個物種的HD-Zip I蛋白也有不同。這些信息為后期研究高羊茅中蛋白功能提供了借鑒意義。

總的來說，位于同一個進化枝內的同源蛋白，其功能也類似。例如擬南芥HB7和HB12對脫落酸信號作出響應，調控干旱脅迫條件下的植物生長[41]，同樣，其在水稻中同源蛋白OsHOX22和OsHOX24通過調控ABA合成來調節水稻的耐旱性[18-19,42]。然而，也有同一亞類內蛋白功能不同的報道。如δ亞族內單雙子葉蛋白的功能明顯不同，且同樣單子葉植物中的同源蛋白都可能不一致。例如，目前報道OsHOX12抑制赤霉素合成，調控水稻節間的伸長[15]，而玉米中OsHOX12同源基因GT1則抑制分蘗芽的伸長[20]。擬南芥中與OsHOX12同源的HB21，HB40及HB53這3個蛋白同時缺失抑制了遮陰脅迫下腋芽的伸長[22]。由此，在進化過程中，HD-Zip I蛋白的功能發生了很大歧化。另外，就目前的研究來說，其他進化枝的蛋白的分子功能如何，也值得以后的工作進一步來鑒定。

3.3 干旱脅迫下高羊茅HD-Zip I基因的表達

研究表明，HD-Zip I蛋白參與植物對生物及非生物脅迫的應答，HD-Zip I可能為激素介導植物響應逆境與自身發育的關鍵節點。多個研究表明HD-ZipI基因的表達水平受到逆境脅迫的顯著影響[6-8,14,18,41-42]。考慮到某些基因的表達本身還有晝夜節律性，本研究中每個取樣時間點均做了相應的對照。結果表明，在24 h內，大部分基因的表達都表現出節律性。在短期PEG6000模擬干旱處理下，大部分基因的表達或多或少在某個時間點發生上調或者下調表達，然而除FaHOX22以外，其余基因的表達變化倍數均不大。這與其他文獻中報道的結果有差異，是由本研究設定的對照導致，且本研究的結果更為準確和有參考意義。在干旱處理7及14 d時，有多個基因表達水平比對照發生了較大程度的上調(如FaHOX6，FaHOX8，FaHOX14，FaHOX16，FaHOX22，FaHOX24及FaHOX25)。目前僅有FaHOX22和FaHOX24在擬南芥及水稻中的同源基因有較深入的研究，其余均未見報道。由此，該結果為高羊茅中這些因子的功能研究提供了參考。此外，本研究沒有涉及高溫、高鹽等其他逆境脅迫和植物激素處理下FaHD-ZipI的表達分析，這些也需要在今后的工作完成。

4 結論

基于高羊茅本地轉錄組數據庫，通過生物信息學分析及分子克隆技術，獲得13個FaHD-ZipI全長開放閱讀框，預測均定位于細胞核。系統進化樹分析表明其分布在5個進化枝，與水稻的HD-ZipI基因有很高的相似性。MEME結構域分析揭示高羊茅與水稻FaHD-Zip I在保守結構域的數目及排布方式基本一致，且與系統進化樹結果吻合。qRT-PCR分析FaHD-ZipI基因在短期及長期PEG6000模擬的干旱脅迫下高羊茅根頸中的表達水平，結果表明11個FaHD-ZipI均能響應干旱脅迫，但是響應快慢和響應的程度有很大區別。本研究結果為后續進行高羊茅HD-ZipI基因的功能研究奠定了工作基礎。

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