小麥細胞周期蛋白基因CDC25的原核表達及蛋白純化

于寶佳　胡艷萍　劉彥妮　李開心　王華忠

摘 要：細胞分裂周期蛋白CDC25是一類蘇氨酸/酪氨酸雙特異性的磷酸酶，在動物上通過激活CDK進而推動細胞周期進程，然而植物CDC25的這一功能可能已經不重要或已被替代，故有關植物CDC25的功能還有待闡明。本研究構建了小麥CDC25基因TaCDC25.1-1AL的原核表達載體；導入大腸桿菌的TaCDC25.1-1AL基因能夠被IPTG誘導表達，表達重組蛋白的表觀分子量與理論分子量基本一致；利用Ni柱親和層析方法獲得了純度較高的重組蛋白，為今后通過體外酶活分析、抗體制備和Western雜交等方法深入研究該蛋白和基因的功能奠定了基礎。

關鍵詞：細胞周期；小麥；CDC25；原核表達

中圖分類號：S512.1 文獻標識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2018.03.003

Abstract：Cell division cycle 25 （CDC25） is a dual-specificity threonine/tyrosine phosphatase， which， in animals， promotes cell cycle progression through activating cyclin-dependent kinases （CDKs）. However， the role of plant CDC25 in cell cycle regulation may be nonessential or has been replaced by other factors. Therefore， the function of plant CDC25 remains to be elucidated. In this study， a prokaryotic expression vector for the wheat CDC25 gene TaCDC25.1-1AL was constructed and transformed into E. coli. Results from SDS-PAGE showed that TaCDC25.1-1AL could express efficiently in E. coli through IPTG induction. The molecular weight of the recombinant protein is consistent with its predicted molecular weight. Recombinant proteins were further purified by the Ni-column affinity chromatography method. The obtaining of purified TaCDC25.1-1AL recombinant proteins laid a foundation for the future studies of in vitro enzyme activity， antibody preparation and western blot analysis on TaCDC25.1-1AL.

Key words： cell cycle； wheat （Triticum aestivum L.）； CDC25； prokaryotic expression

細胞分裂周期蛋白CDC25（Cell division cycle 25）是一類蘇氨酸/酪氨酸雙特異性的磷酸酶，屬于絡氨酸磷酸酶家族。酵母和動物上，Wee1和CDC25拮抗調控驅動細胞周期G2/M期轉變的CDK激酶活性，Wee1激酶通過磷酸化作用負調控CDK活性，CDC25磷酸酶則同通過去磷酸化相同位置殘基起正調控作用[1-3]。與動物不同的是，植物CDC25在細胞周期調控中的作用可能已經喪失。相關研究表明，擬南芥CDC25基因在快速生長的組織中不表現上調表達[4]；突變或過表達擬南芥CDC25不影響細胞周期長短和植株正常生長[5-6]。但是也有一些證據說明高等植物依然保留了CDC25-CDK這一調控通路，如擬南芥CDC25在酵母細胞中、酵母CDC25在煙草中過表達均表現細胞周期調控作用[4，7-9]；擬南芥CDC25突變體對羥基脲（一種DNA復制抑制劑）表現超敏感特征，說明CDC25可能參與了對G2/M期轉變相關的DNA復制檢驗點的響應[5]。除尚不明確的細胞周期調控作用外，擬南芥、絨毛草、水稻和蜈蚣草等植物的CDC25還具有砷酸還原酶活性，作用于植物體內砷解毒的重要步驟——五價砷到三價砷的還原[6，10-14]。

目前高等植物CDC25研究主要集中在擬南芥、水稻等模式物種上，在重要農作物小麥上的相關研究還未見報道。本研究在前期克隆小麥CDC25基因TaCDC25.1-1AL的基礎上，構建了該基因的原核表達載體，經大腸桿菌誘導表達和重組蛋白純化過程獲得了小麥TaCDC25.1-1AL的純化重組蛋白，為下一步體外酶活測定、抗體制備和Western雜交等實驗奠定了基礎。

1 材料和方法

1.1 基因和載體

小麥CDC25基因TaCDC25.1-1AL的全長cDNA由本實驗室克隆于pLB-C25.1A載體上。原核表達載體pET30a由本實驗室保存。

1.2 原核表達載體的構建

設計合成用于擴增TaCDC25.1-1AL基因完整ORF的引物對C25.1-F（GGGGTACCAT GGCGCGAAGCGTGTCGTA）/C25.1-R（CGGGATCCTCAAGAGCATGTGCCTTTGC），擴增產物兩端帶上KpnⅠ和BamHⅠ酶切位點。使用該引物對和高保真pfu DNA聚合酶，以pLB-C25.1A質粒為模板進行PCR擴增。擴增產物和pET30a質粒經KpnⅠ和BamHⅠ雙酶切后進行連接。連接產物轉化大腸桿菌后，使用菌落PCR和酶切方法鑒定重組克隆，鑒定到的重組表達載體經測序進行進一步確認。采用熱激法將表達載體導入到大腸桿菌表達菌株BL21（DE3）中。

1.3 原核表達

接種攜帶表達載體質粒的大腸桿菌BL21（DE3）到2 mL含50·mg L-1卡那霉素的LB液體培養基中，37 ℃ 振蕩培養過夜。按1% 的比例擴大到10 mL 相同的液體培養基中，37 ℃ 振蕩培養至對數生長期（3 h左右）。加入終濃度為0.5 mmol·L-1的IPTG，于28 ℃ 條件下震蕩培養誘導目標基因的表達。分別于誘導后0，2，4，6，8 h取1 mL菌液用于總蛋白的SDS-PAGE電泳分析。

1.4 SDS-PAGE電泳

將1 mL菌液于10 000 rpm離心10 min，沉淀加入80 μL的ddH2O重懸，再加入20 μL的5X蛋白電泳上樣緩沖液并混勻，沸水浴10 min。裂解的細胞于12 000 rpm離心5 min，取20 μL上清上樣進行SDS-PAGE電泳（13% 分離膠，4% 濃縮膠）。電泳后用考馬斯亮藍R-250染色液染色1 h，脫色液脫色至背景無色后觀察并拍照。

1.5 重組蛋白的純化

重組蛋白N端含組氨酸標簽His（6），因此使用Ni-Agarose His標簽蛋白純化試劑盒（康為世紀）在非變性條件下純化重組蛋白。層析柱平衡、菌體超聲波破碎、可溶性蛋白上樣及雜蛋白清洗等過程參照試劑盒手冊進行。分別使用3 mL含50，100，200，300，500 mmol·L-1 咪唑的洗脫液分段洗脫目標蛋白。收集各階段的洗脫液進行SDS-PAGE（13% 分離膠，4% 濃縮膠）電泳和考馬斯亮藍R-250染色、脫色。純化的蛋白質洗脫液于-80 ℃冰箱保存。

2 結果與分析

2.1 小麥TaCDC25.1-1AL基因原核表達載體的構建

通過PCR擴增獲得了TaCDC25.1-1AL基因400 bp的完整ORF片段（圖1），擴增片段兩端帶上了引物所含有的KpnⅠ（起始密碼一端）和BamHⅠ（終止密碼一端）識別位點。對擴增片段和pET30a載體質粒進行KpnⅠ和BamHⅠ雙酶切，電泳結果表明載體質粒被正確地切成線狀結構，也間接表明擴增片段兩端得到正確酶切（圖2）。將酶切后的片段和載體進行連接并進行大腸桿菌轉化，隨機挑取轉化后培養基上長出的菌落作為模板，使用擴增TaCDC25.1-1AL基因ORF的引物對C25.1-F/C25.1-R進行菌落PCR擴增，結果表明挑取的4個菌落均能夠正確擴增出400 bp的插入基因片段（圖3）。選擇1個菌落PCR擴增陽性的克隆進行質粒提取和KpnⅠ、BamHⅠ雙酶切，結果插入基因片段能夠正確地從重組載體上切出（圖4）。重組載體經測序得到進一步確認，表明TaCDC25.1-1AL原核表達載體構建成功，并將其命名為pET-TaC25.1A。

2.2 小麥TaCDC25.1-1AL基因的原核表達

將原核表達載體pET-TaC25.1A導入大腸桿菌BL21（DE3）后，將大腸桿菌在28 ℃、添加0.5 mmol·L-1 IPTG的LB培養基中震蕩培養，誘導目的基因TaCDC25.1-1AL的表達。如圖5的大腸桿菌總蛋白電泳結果所示，未經IPTG誘導的總蛋白中無目標重組蛋白條帶，而經IPTG 誘導后的總蛋白中出現融合組氨酸標簽的His（6）-TaCDC25.1-1AL重組蛋白條帶，重組蛋白表觀分子量與理論分子量（18.3 kDa）基本一致，其表達量在誘導后0～8 h時間段內隨誘導時間的延長逐漸增加。

2.3 原核表達TaCDC25.1-1AL重組蛋白的純化

使用Ni 柱親和層析方法從經IPTG誘導8 h的大腸桿菌總可溶性蛋白中純化His（6）-TaCDC25.1-1AL重組蛋白。如圖6所示，總蛋白上樣后的流穿液（泳道3）中幾乎沒有重組蛋白，說明重組蛋白掛柱情況良好；再經15倍柱體積含10 mmol·L-1 咪唑的溶液洗滌雜蛋白后（未上樣電泳），使用50～500 mmol·L-1的梯度咪唑濃度洗脫液洗脫重組蛋白，電泳結果表明，300，500 mmol·L-1 咪唑濃度洗脫液中的重組蛋白純度較高，可滿足后續的酶活測定和抗體制備等試驗要求。

3 結論與討論

目前植物CDC25基因的功能尚不明確，其細胞周期調控角色已不重要或被替代，砷解毒功能也只在砷脅迫環境中起作用，而且也只是次要通路[3，15-16]。因此，有必要對CDC25在植物上存在的意義，以及在其他生物過程中的未知功能開展更深入的研究。體外酶活性和蛋白質性質分析以及基于抗體的蛋白質免疫學研究方法等都離不開目標基因產物蛋白的獲得。本研究以小麥為研究對象，利用常規的PCR、酶切、連接和測序等方法構建了基于pET30a的小麥CDC25基因TaCDC25.1-1AL的原核表達載體；在大腸桿菌中，該載體上的TaCDC25.1-1AL基因能夠被IPTG誘導表達，產生的重組蛋白攜帶His（6）標簽，分子量與理論值基本一致；通過Ni柱親和層析過程中的梯度咪唑濃度洗脫液洗脫，在300～500 mmol·L-1咪唑濃度洗脫液中獲得了純度較高的TaCDC25.1-1AL重組蛋白。鑒于擬南芥和水稻的CDC25都具有體外的磷酸酶活性和砷酸還原酶活性[10，14，17]，小麥TaCDC25.1-1AL重組蛋白的獲得為今后對其進行體外酶學分析奠定了基礎，亦可作為抗原用于抗體制備，繼而應用于小麥CDC25功能研究的免疫學方法中。

參考文獻：

[1]DUNPHY W G， KUMAGAI A. The cdc25 protein contains an intrinsic phosphatase activity [J]. Cell， 1991， 67： 189-196.

[2]KUMAGAI A， DUNPHY W G. The cdc25 protein controls tyrosine dephosphorylation of the cdc2 protein in a cell-free system [J]. Cell， 1991， 64： 903-914.

[3]FRANCIS D. A commentary on the G2/M transition of the plant cell cycle [J]. Ann bot， 2011， 107： 1065-1070.

[4]SORRELL D A， CHRIMES D， Dickinson J R， et al. The Arabidopsis CDC25 induces a short cell length when overexpressed in fission yeast： evidence for cell cycle function[J]. New phytol， 2005， 165： 425-428.

[5]SPADAFORA N D， DOONAN J H， HERBERT R J， et al. Arabidopsis T-DNA insertional lines for CDC25 are hypersensitive to hydroxyurea but not to zeocin or salt stress[J]. Ann bot， 2011， 107： 1183-1192.

[6]DISSMEYER N， WEIMER A K， PUSCH S， et al. Control of cell proliferation， organ growth， and DNA damage response operate independently of dephosphorylation of the Arabidopsis CDK1 homolog CDKA；1 [J]. Plant cell， 2009， 21： 3641-3654.

[7]ORCHARD C B， SICILIANO I， SORRELL D A， et al. Tobacco BY-2 cells expressing fission yeast cdc25 bypass a G2/M block on the cell cycle [J]. Plant J， 2005， 44： 290-299.

[8]BELL M H， HALFORD N G， ORMROD J C， et al. Tobacco plants transformed with cdc25， a mitotic inducer gene from fission yeast [J]. Plant mol biol， 1993， 23： 445-451.

[9]MCKIBBIN R S， HALFORD N G， FRANCIS D. Expression of fission yeast cdc25 alters the frequency of lateral root formation in transgenic tobacco[J]. Plant mol biol， 1998， 36： 601-612.

[10]ELLIS D R， GUMAELIUS L， INDRIOLO E， et al. A novel arsenate reductase from the arsenic hyperaccumulating fern Pteris vittata [J]. Plant physiol， 2006， 141： 1544-1554.

[11]CESARO P， CATTANEO C， BONA E， et al. The arsenic hyperaccumulating Pteris vittata expresses two arsenate reductases [J]. Sci rep， 2015， 5： 14525.

[12]DUAN G L， ZHU Y G， TONG Y P， et al. Characterization of arsenate reductase in the extract of roots and fronds of Chinese brake fern， an arsenic hyperaccumulator [J]. Plant physiol， 2005， 138： 461-469.

[13]BLEEKER P M， HAKVOORT H W， BLIEK M， et al. Enhanced arsenate reduction by a CDC25-like tyrosine phosphatase explains increased phytochelatin accumulation in arsenate-tolerant Holcus lanatus [J]. Plant J， 2006， 45： 917-929.

[14]DUAN G L， ZHOU Y， TONG Y P， et al. A CDC25 homologue from rice functions as an arsenate reductase[J]. New phytol， 2007， 174： 311-321.

[15]SANCHEZ-BERMEJO E， CASTRILLO G， DEL LIANO B， et al. Natural variation in arsenate tolerance identifies an arsenate reductase in Arabidopsis thaliana[J]. Nat commun， 2014， 5： 4617.

[16]CHAO D Y， CHEN Y， CHEN J， et al. Genome-wide association mapping identifies a new arsenate reductase enzyme critical for limiting arsenic accumulation in plants[J]. PLoS biol， 2014， 12： e1002009.

[17]LANDRIEU I， DA C M， De V L， et al. A small CDC25 dual-specificity tyrosine-phos- phatase isoform in Arabidopsis thaliana[J]. Proc natl acad sci USA， 2004， 101： 13380-13385.