幾株適用于發酵肉制品的乳酸菌的分離篩選及鑒定

李建 ，李麗 ，彭翠珍 ，羅碧霞 ，曾雄 ，宗緒巖 ，2，*

（1.四川理工學院 生物工程學院，四川自貢643000；2.釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室，四川自貢643000）

發酵肉制品是指在自然或人工控制條件下，利用微生物發酵作用生產的具有特殊風味、色澤和質地，且具有較長保存期的肉制品[1]。雖然不同地方的產品特點各不相同，但微生物的代謝活動對其風味物質形成均起著至關重要的作用[2]。我國傳統發酵肉制品多采用自然發酵的生產工藝，經自然富集的微生物發酵的肉制品有時會由于發酵失敗而使其產品質量參差不齊，安全性難以得到保障[3-4]。采用經篩選的性能優良的菌種作為發酵劑，定向接種于肉制品發酵，則可以有效控制發酵過程，從而提高產品的穩定性和安全性、感官及其它特性[5-6]。

乳酸菌是最早從發酵肉制品中分離出來的微生物，在整個發酵過程中占有絕對優勢[7-8]。其作用主要體現在兩個方面：一是發酵產生乳酸，降低肉制品的pH值[9]。在酸性條件下，肌肉蛋白變性形成膠狀組織，從而提高了肉品的硬度與彈性[10]。另一方面，沙門氏菌、李斯特桿菌等致病菌的生長得到抑制，同時大多數乳酸菌能產細菌素，可進一步提高發酵的競爭力[9]。此外，發酵所營造的酸性環境和乳酸菌的觸酶活性，促進了亞硝酸鹽的分解，降低了殘留的NO2-與二級胺作用生成亞硝胺的可能性[11]。二是有利于風味物質的形成。發酵所產的乳酸雖然沒有典型的風味/香氣化合物的特性，但可以賦予肉品特征性的酸味[12]。

目前應用于發酵肉制品生產中的乳酸菌種類較多，包括植物乳桿菌、清酒乳桿菌、乳酸乳桿菌、乳酸片球菌等[13]。周才瓊[14]研究渝黔地區傳統酸肉微生物種群發現，乳酸菌優勢菌群主要是片球菌屬和乳桿菌屬。Dertli等[15]研究了乳酸菌對土耳其發酵香腸的影響，發現其對于協調香腸的彈性及黏度有積極作用。葛平珍等[16]從發酵酸肉中分離得到1株高效降膽固醇的短乳桿菌，并對其降膽固醇作用進行了研究，結果表明，膽固醇降低過程中同化作用大于沉淀作用。Fang Yang[17]對香腸發酵過程中內源蛋白酶以及植物乳桿菌的降解活性進行了研究，前者主要降解肌漿蛋白質、肌原纖維蛋白質，后者主要水解肌肽。鞏洋等[18]將戊糖片球菌和植物乳桿菌、葡萄球菌按不同添加比例制作發酵劑，研究了低酸度川味香腸的加工工藝。植物乳桿菌在改善風味，提高肉制品的食用安全性上效果較好，而清酒乳桿菌則對不同來源肉質的適應性較強，能夠保證在整個發酵過程中處于生長優勢[13]。

本研究采用稀釋平板法對自然發酵香腸及泡菜水中的乳酸菌進行分離鑒定，檢測了其產酸、產氣、產黏液等發酵特性，并研究了其在不同溫度、pH值、NaCl、NaNO2的條件下的生長情況，以期得到適用于肉制品發酵劑的乳酸菌菌種，為肉制品乳酸菌發酵劑的開發提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌種：菌株分別從泡菜水及自然發酵香腸中分離得到，泡菜水取樣于自貢市大安區農家，香腸購于自貢市匯東通達農貿市場；細菌基因組DNA提取試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司；牛肉膏、蛋白胨、酵母浸膏（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術有限責任公司；L-精氨酸、葡萄糖、檸檬酸氫二銨、乙酸鈉、磷酸氫二鉀、氯化鈉、亞硝酸鈉、碳酸鈣、乙酸鉛、硫酸鎂、硫酸錳等（均為分析純）：成都金山化學試劑有限公司；脫脂乳粉、豬油、中性紅指示劑：合肥博美生物科技有限責任公司。

1.2 儀器與設備

全自動高壓滅菌鍋（MLS-3020）：致微（廈門）儀器有限公司；微生物培養箱（LS-I201）：飛世爾實驗器材（上海）有限公司；紫外可見分光光度計（UV-2000）：湘藝儀器（上海）有限公司；厭氧罐氣體控制系統（Whitley Jar Gassing system）：北京中科星宇商貿有限公司；電子天平（JE2002）：上海浦春計量儀器有限公司；筆式酸度計（PH-100）：浙江力辰儀器科技有限公司；生物顯微鏡（DM300）：徠卡儀器（德國）有限公司；大型臺式恒溫冷凍搖床（MaxQ4000）：上海智城分析儀器制造有限公司；高效落地高速離心機：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；PCR儀：美國Thermo公司；電泳儀（DYY-12）：北京百晶生物技術有限公司；凝膠成像分析系統（Bio-best200E）：美國西蒙公司；臺式高速微量（冷凍型）離心機（D3024）：上海珂淮儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 乳酸菌的分離純化及初步篩選

參考GB 4789.35-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》，遵循無菌操作，用滅菌的剪刀剪取25 g香腸肉餡，用225 mL無菌生理鹽水稀釋，用拍打式均質機作均質處理。分別將泡菜水、香腸肉餡樣品處理液作10倍系列稀釋，取104、105、106倍稀釋液100 μL涂布于MRS固體培養基平板（含質量分數3%的碳酸鈣）上，于37℃厭氧培養48 h，選取有溶鈣圈且符合乳酸菌菌落形態（菌落呈圓形，中等大小，凸起，微白色，濕潤，邊緣整齊）的菌落，在MRS固體培養基上進行反復劃線純化[4]。對純化好的菌株進行革蘭氏染色及過氧化氫酶試驗，選取過氧化氫酶陰性、革蘭氏陽性、不形成芽孢的菌株作為初篩菌株[6]。

1.3.2 菌液光密度值的測定

用紫外分光光度計在600 nm條件下比色，測定菌液的OD值。分別用相應的未接入菌種的培養液作空白[19]。

1.3.3 菌株復篩試驗

作為肉制品的發酵劑應該具備以下特性：在添加6%NaCl和150 mg/kg NaNO2條件下仍然能良好生長，產酸能力較強，發酵葡萄糖不產氣、不產H2S、不產氨、不產黏液，不具有氨基酸脫羧酶活性，對蛋白質和脂肪無明顯的分解作用等特點[20]。據此進行以下篩選試驗。

耐鹽、耐亞硝酸鹽試驗：將待測菌分別接種于已添加質量分數為0%、2%、4%、6%NaCl及質量濃度為 0、5、10、15 mg/100 mL NaNO2的 MRS 液體培養基中，于37℃下培養24 h后測定吸光度值的變化[21]。

菌株的生長曲線及產酸能力的測定：將待測菌株接種于MRS液體培養基，37℃條件下培養24 h，每2 h測定一次菌液的OD值和pH值[22]。

不同溫度條件下菌株的生長能力：將待測菌株接種于MRS液體培養基，分別于10、20、30、40℃條件下培養24 h，測定菌液的OD值[23]。

不同pH值條件下菌株的生長能力：將待測菌株接種于 MRS 液體培養基（pH3.5、4.5、5.5、6.5），37 ℃條件下培養24 h，測定菌液的OD值[23]。

產黏性實驗、過氧化氫酶測定實驗、葡萄糖產氣實驗、H2S產生實驗、精氨酸產氨實驗、氨基酸脫羧酶實驗、乳酸的紙層析分析，參考《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》，而蛋白質降解活性實驗、脂肪分解活性實驗則參考段艷的方法[23]。

1.3.4 16S rDNA分子生物學鑒定

按照試劑盒說明書進行細菌基因組DNA的提取，并以所得細菌的基因組DNA為模板，用細菌16S rDNA通用引物 27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGYTACCTTGTTACGACTT-3′）作為上下游引物進行PCR擴增。PCR擴增體系和PCR反應條件按照參考文獻[24]進行，然后將PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，條件為 80 V，60 min，Marker為 DL2000，并將PCR產物送至送派森諾生物科技股份有限公司（上海）測序，測序結果在NCBI基因庫中進行BLAST同源性分析。

2 結果與討論

2.1 菌株的分離及純化

挑選溶鈣圈較大的菌落，通過反復劃線純化培養，并排除革蘭氏陰性及過氧化氫酶陽性菌株，選取紙層析Rf值與0.02 g/mL乳酸接近的菌株，最后共得到14株疑似乳酸菌菌株。其中9株篩選自香腸（編號為 XC-1、XC-2……XC-9），5株篩選自泡菜水（編號為PC-1、PC-2……PC-5）。14株菌的菌落特征基本相似，為凸透鏡狀，呈現出乳白色、表面光滑圓潤、邊緣整齊的特點。

2.2 菌株對NaCl的耐受性

菌株對不同質量濃度NaCl的耐受性見表1。

表1 菌株對不同質量濃度NaCl的耐受性Table 1 NaCl tolerance of different lactic acid bacteria at different NaCl concentration

由表1可知，隨著MRS液體培養基中NaCl添加量的增加，14株受測菌株的生長受到了不同程度的抑制。當NaCl的添加量到達6 g/100 mL時，僅XC-3、XC-5、XC-9、PC-1、PC-3表現出較強的耐受性，因此選取這5株菌作進一步篩選。

2.3 菌株對NaNO2的耐受性

亞硝酸鹽常用作防腐劑、發色劑而添加于發酵肉制品中，而肉制品在其發酵過程中也會產生少量的亞硝酸鹽，因此要求菌株對亞硝酸鹽應有一定的耐受性[25]。菌株對不同質量濃度NaNO2的耐受性見表2。

表2 菌株對不同質量濃度NaNO2的耐受性Table 2 NaNO2tolerance of different lactic acid bacteria at different NaNO2concentration

由表2可知，亞硝酸鹽的添加一定程度上影響了受測菌株的生長代謝。當添加量到達15 mg/100 mL時，5株菌仍能生長，這表明受測菌株對亞硝酸鹽均具有較好的耐受力，可用作進一步篩選。

2.4 篩選菌株的發酵特性

菌株的發酵特性見表3。

表3 篩選菌株的主要發酵特性Table 3 Fermentation characteristics of selected strains

由表3可知，5株受測菌株均不產黏液，不產H2S，發酵葡萄糖不產氣，不具備蛋白質、脂肪分解能力，因此可對其產酸能力、不同pH值、溫度條件下的生長情況等作進一步研究。

2.5 菌株的產酸能力

產酸能力是篩選乳酸菌的一個重要指標，發酵所產的乳酸能夠賦予發酵肉制品特征性的酸味[26]。此外，在酸性條件下，沙門氏菌、李斯特桿菌等致病菌的生長得到抑制[27]。菌株的產酸曲線見圖1。

圖1 分離菌株的產酸曲線Fig.1 Production acid rate curve of isolated strain

由圖1可知，5株菌的培養基pH值隨培養時間的延長呈現出先迅速下降后趨于平緩的特點。培養24 h后，除PC-1外，其余4株受測菌株所處的培養基的pH值均下降到了4.0左右，符合肉制品發酵劑的產酸要求。

2.6 菌株的生長曲線

菌株的生長曲線見圖2。

由圖2可知，4株受測菌株均具備良好的環境適應能力，延滯期相對較短。接種后迅速生長繁殖，菌體濃度顯著增加，隨后生長曲線趨于平緩，進入穩定增長期。

圖2 分離菌株的生長曲線Fig.2 Growth rate curves of selected strains

2.7 菌株在不同溫度下的生長能力

通常要求應用于肉制品發酵的乳酸菌在15℃～40℃條件下能夠生長，低溫條件下仍具備較強的生長能力，最適生長溫度為30℃～37℃[3]。菌株在不同溫度下的生長能力見圖3。

圖3 分離菌株在不同溫度下的生長能力Fig.3 Effect of different temperature on the growth of selected strains

由圖3可知，不同培養溫度對4株受測菌株影響不同，但均滿足要求。

2.8 菌株的在不同pH下的生長能力

菌株在不同pH下的生長情況見圖4。

圖4 分離菌株在不同pH值下的生長能力Fig.4 Effect of different pH on the growth of selected strains

由圖4可知，4株受測菌株在不同pH值的MRS液體培養基中均能生長。肉品發酵結束后其pH值多低于5.3，而本試驗篩選得到的4株菌均能夠在pH4.5的條件下較好地生長，因此適合作為肉制品的發酵劑。

2.9 菌株16S rRNA序列分析

對篩選得到的4菌株的16S rDNA擴增產物進行電泳分析，電泳結束后在凝膠成像系統下觀察拍照，結果如圖5所示。

圖5 乳酸菌的16S rDNA的PCR產物電泳圖Fig.5 The electrophoresis of 16S r DNA PCR amplification of LAB

在約為1 500 bp處出現熒光條帶，與預期結果一致。之后將產物送至測序公司測序，將所測得的序列在NCBI上進行BLAST同源性分析，結果如表4所示。

表4 4株菌株的序列分析Table 4 Sequence analysis of selected strains

由表4可知，從香腸中篩選得到3株菌XC-3、XC-5、XC-9與植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）有99%的同源性。而從泡菜水中篩選得到菌株PC-3與鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）有99%的同源性。當16S r RNA序列同源性高于97%時，可認為是屬內的同種，因此確定XC-3、XC-5、XC-9為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），PC-3為鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus strain）。

3 結論

乳酸菌在改善發酵肉制品風味，提高產品安全性方面具有重要的作用，為篩選得到適合于肉制品發酵的乳酸菌，分別以泡菜水、自然發酵香腸為樣品，從中分離篩選得到14株乳酸菌疑似菌株。參考肉制品發酵劑對乳酸菌的要求，分別檢測了菌株對NaCl、NaNO2的耐受性、是否產黏液等發酵特性以及產酸、不同溫度、pH值條件下的生長能力，最終排除了9株對NaCl的耐受性較差以及1株產酸能力較弱的菌株，將4株符合要求的菌株進行測序，經形態學及同源性分析，結果表明：從香腸中篩選得到的3株菌為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），而從泡菜水中篩選得到1株菌為鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）。

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