生物防腐劑對(duì)食源性致病菌抑制效果的初步探究

鐘俊良，魏彩姣，孫雪言，趙喜紅

（武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院，湖北武漢430073）

食品防腐劑在食品的生產(chǎn)過程中發(fā)揮著不可取代的作用，是重要的食品添加劑，對(duì)食品的保存和風(fēng)味的保持發(fā)揮著關(guān)鍵作用，是目前食品以及相關(guān)行業(yè)研究的重點(diǎn)[1]。防腐劑主要有天然生物防腐劑和人工合成防腐劑兩大類，天然生物型防腐劑是通過抑制微生物在食品中的生長(zhǎng)繁殖和抑制食品中氧化、酶促等反應(yīng)來發(fā)揮作用的[2]，而日常生活中用的化學(xué)防腐劑大多都是人工合成的，如苯甲酸鈉和山梨酸鉀等。由于化學(xué)類防腐劑具有潛在毒性，在一定程度上損害人體健康，所以天然生物防腐劑因安全無毒和抗菌性好等特點(diǎn)而逐漸成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。

乳酸鏈球菌素（Nisin）作為一種新型的細(xì)菌素天然生物防腐劑，具有安全、無毒的特性而廣泛應(yīng)用于肉制品、乳制品、腌漬食品等。Nisin對(duì)大部分的G+菌有比較強(qiáng)的抑制效果，比如耐熱腐敗菌、產(chǎn)芽孢桿菌、生孢梭菌等細(xì)菌，但對(duì)大部分G-菌及真菌無抑制效果[3]。納他霉素是微生物源天然生物防腐劑中的經(jīng)多種霉菌發(fā)酵產(chǎn)生的環(huán)內(nèi)酯類抗生素[4]。納他霉素相比較于其他的抑菌素，對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞毒性極低，已被批準(zhǔn)可作為食品防腐劑和抗真菌劑應(yīng)用于肉類、乳制品等食品的加工貯藏[5]。植酸是從植物的種子里提取出來的純天然無毒物質(zhì)，對(duì)絕大多數(shù)金屬離子有極強(qiáng)的螯合能力，能夠抑制大部分G+及其芽孢的生長(zhǎng)與繁殖[6]。

本實(shí)驗(yàn)依據(jù)GB 2760-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定的食品添加劑最大使用量（0.1%），通過控制變量研究上述天然生物防腐劑在不同濃度下分別對(duì)單核增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）和大腸桿菌O157：H7（Escherichia coli O157：H7）的抑制效果，同時(shí)使用苯甲酸鈉作為對(duì)照組比較化學(xué)防腐劑與生物防腐劑的抑菌效果，以期為食源性致病菌的安全控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Nisin、胰蛋白胨、酵母膏提取物：青島海博生物技術(shù)有限公司；納他霉素：河北大唐生物工程有限公司；植酸：廣州全奧化工產(chǎn)品有限公司；苯甲酸鈉：青島豐泰化工有限公司；酒精、醫(yī)用酒精：廣州全奧化工產(chǎn)品有限公司；氯化鈉：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；瓊脂：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；無菌水：武漢工程大學(xué)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 儀器與設(shè)備

CHA-SA數(shù)顯恒溫振蕩器：常州市國(guó)旺儀器制造有限公司；DSX-280KB30手提式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-2FB超凈工作臺(tái)：上海尚道儀器制造有限公司；ME104E/02電子天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；SPX-150BSH-Ⅱ生化培養(yǎng)箱：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；OHG-9073BS-Ⅲ電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；HH-S2智能數(shù)顯恒溫水浴鍋：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司。

1.3 試驗(yàn)菌種

本試驗(yàn)中所用標(biāo)準(zhǔn)菌株均來源于美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所（ATCC），包括單核細(xì)胞增生李斯特菌（ATCC 19114）、蠟樣芽孢桿菌（ATCC 13061）、大腸桿菌 O157：H7（ATCC 43895）。

1.4 培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨10 g，酵母膏5 g，氯化鈉10 g，瓊脂15 g；牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨 10 g，酵母膏 5 g，氯化鈉 10 g。

1.5 方法

1.5.1 細(xì)菌活化及菌懸液的制備

菌株單核增生李斯特菌、蠟樣芽孢桿菌和大腸桿菌O157：H7保藏在-20℃、50%的甘油中，用移液槍取0.1 mL保藏菌液接入裝有9.9 mL液體培養(yǎng)基的試管中，置于37℃的搖床上130 r/min震蕩培養(yǎng)12 h（約108CFU/mL），于4℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 單一防腐劑對(duì)3種食源性致病菌抑制作用研究

將Nisin、納他霉素、植酸和苯甲酸鈉按照GB 2760-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定的最大添加量稀釋成不同的質(zhì)量濃度，添加到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，分別接入1 mL上述保存的菌種，各防腐劑最終濃度如表1所示。將已接種試管置于37℃的培養(yǎng)箱中隔夜培養(yǎng)12 h后，用稀釋涂布平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行計(jì)數(shù)。

表1 防腐劑的最終濃度Table 1 The final concentration of preservatives

1.6 分析方法

使用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定得出菌落數(shù)后，用致病菌的抑菌率來評(píng)價(jià)各個(gè)防腐劑對(duì)致病菌的抑菌效果。抑菌率計(jì)算公式如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 單一防腐劑對(duì)3種食源性致病菌的抑制效果

2.1.1 不同濃度的Nisin對(duì)致病菌的抑制效果

在國(guó)標(biāo)濃度范圍0.1%內(nèi)，Nisin對(duì)3種食源性致病菌有不同程度的抑制作用，結(jié)果見圖1。

圖1 不同濃度的Nisin對(duì)單增李斯特菌、蠟樣芽孢桿菌和大腸桿菌O157：H7的抑菌率Fig.1 Depression effect of the different density of Nisin on Listeria monocytogenes，Bacillus cereus and E.coli O157：H7

由圖1可知，Nisin對(duì)單增李斯特菌和蠟樣芽孢桿菌的抑制效果最明顯，當(dāng)Nisin質(zhì)量濃度為0.01%時(shí)，單增李斯特菌和蠟樣芽孢桿菌的抑菌率分別為99.92%和98.78%，而大腸桿菌O157：H7的抑菌率只有46.07%。當(dāng)Nisin濃度達(dá)到0.02%時(shí)，單增李斯特菌和蠟樣芽孢桿菌的抑制率已達(dá)100%，但大腸桿菌O157：H7的抑菌率只有52.81%。當(dāng)濃度達(dá)到國(guó)標(biāo)0.1%時(shí)，大腸桿菌O157：H7抑制率只有61.12%。據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，當(dāng)Nisin的濃度高于10 μg/mL（0.000 1%）時(shí)對(duì)單增李斯特菌有一定的殺菌作用，當(dāng)其濃度高于150 μg/mL（0.015%）時(shí)，幾乎所有的單增李斯特菌都被殺死[7]，與本試驗(yàn)結(jié)果相符合。雖然Nisin對(duì)大腸桿菌O157：H7的抑制效果不理想，但隨著Nisin濃度的增加，其對(duì)大腸桿菌O157：H7的抑制效果緩慢提高。

本文的水系統(tǒng)指的是城市人工水系統(tǒng)，包括與城市水資源開發(fā)利用有關(guān)的水源取水、供水、輸水、用水、排水、污水處理與回用等環(huán)節(jié)。除了各個(gè)環(huán)節(jié)基礎(chǔ)設(shè)施的建造需要消耗大量的物資和能源之外，水系統(tǒng)在運(yùn)行過程中也需要大量的能源投入，例如城市供水管網(wǎng)的輸配水能耗，污水處理廠進(jìn)行污水處理的能耗等。在城市水系統(tǒng)巨大能源消耗的背后是可觀的碳排放。在我國(guó)，已有研究和經(jīng)驗(yàn)表明給排水行業(yè)是城市的用電大戶，目前我國(guó)大多數(shù)供水企業(yè)的平均耗電量占總制水成本的20%~30%，城市水系統(tǒng)運(yùn)行中的碳排放不容忽視。

2.1.2 不同濃度的納他霉素對(duì)致病菌的抑制效果

不同濃度的納他霉素對(duì)致病菌的抑制效果見圖2。

圖2 不同濃度的納他霉素對(duì)單增李斯特菌、蠟樣芽孢桿菌和大腸桿菌O157：H7的抑菌率Fig.2 Depression effect of the different density of Natamycin on Listeria monocytogenes，Bacillus cereus，and E.coli O157：H7

從圖2可得，當(dāng)濃度為0.01%～0.05%時(shí)，納他霉素對(duì)3種致病菌的抑菌率在20%內(nèi)上下起伏，可能是平板計(jì)數(shù)法存在一定的測(cè)量誤差所致，可以認(rèn)為在該濃度范圍內(nèi)納他霉素?zé)o法抑制3種致病菌。當(dāng)濃度到達(dá)0.1%時(shí)，3種致病菌的抑菌率明顯提高，分析原因可能是由于較高濃度的納他霉素會(huì)在一定程度上改變了膜內(nèi)外滲透壓，從而抑制住了部分細(xì)菌的生長(zhǎng)。

2.1.3 不同濃度的植酸對(duì)致病菌的抑制效果

不同濃度的植酸對(duì)致病菌的抑制效果見圖3。

圖3 不同濃度的植酸對(duì)單增李斯特菌、蠟樣芽孢桿菌和大腸桿菌O157：H7的抑菌率Fig.3 Depression effect of the different density of Phytic acid on Listeria monocytogenes，Bacillus cereus，and E.coli O157：H7

隨著植酸濃度的變化，3種致病菌的數(shù)量級(jí)雖然沒有改變，但致病菌的抑菌率隨著濃度的升高而表現(xiàn)逐漸提高的趨勢(shì)。當(dāng)植酸的濃度為0.01%時(shí)，蠟樣芽孢桿菌的抑菌率為9.43%，但單增李斯特菌和大腸桿菌O157：H7的抑菌率為0%。當(dāng)濃度提高到0.02%時(shí)，植酸對(duì)3種致病菌表現(xiàn)出微弱的抑制效果。當(dāng)濃度達(dá)到0.03%以后，植酸對(duì)3種致病菌的抑制效果逐漸提高，其中對(duì)單增李斯特菌的抑制效果最好，而對(duì)大腸桿菌O157：H7的抑制率最低，分析原因可能是因?yàn)榇竽c桿菌具有極強(qiáng)的耐酸性[8]，相對(duì)于其他兩種致病菌更適合生存在植酸的低pH值環(huán)境中，另外有文獻(xiàn)報(bào)道了植酸對(duì)大腸桿菌O157：H7的最小抑制濃度為0.4%[9]，說明了高濃度的植酸才能有效抑制大腸桿菌O157：H7的生長(zhǎng)。其次，植酸極強(qiáng)的螯合能力能夠抑制大部分G+菌及其芽孢的生長(zhǎng)與繁殖。但從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，植酸的抑菌效果不佳，可考慮與Nisin進(jìn)行復(fù)配從而提高抑菌效果。有研究表明，1 mg/mL的Nisin與1.5 mg/mL的植酸進(jìn)行復(fù)配可以有效抑制菌液濃度在106CFU/mL的食源性致病菌[10]。

2.1.4 不同濃度的苯甲酸鈉對(duì)致病菌的抑制效果

不同濃度的苯甲酸鈉對(duì)致病菌的抑制效果見圖4。

由圖4可知，隨著苯甲酸鈉的濃度增加，3種致病菌的抑菌率也逐步增加，但整體抑菌效果不佳。本試驗(yàn)探究了當(dāng)苯甲酸鈉濃度達(dá)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)0.1%時(shí)，單增李斯特菌、大腸桿菌O157：H7和蠟樣芽孢桿菌的抑菌率只有66.15%、54.41%和45.19%。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，當(dāng)苯甲酸鈉濃度為0.3%時(shí)才能顯著地抑制住大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)[11]，而楊榮杰[12]也通過實(shí)驗(yàn)得出苯甲酸鈉對(duì)蠟樣芽孢桿菌的最小抑制濃度為1%，這說明了苯甲酸鈉的濃度需要超過國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)濃度才能夠抑制住食源性致病菌的生長(zhǎng)。

圖4 不同濃度的苯甲酸鈉對(duì)單增李斯特菌、蠟樣芽孢桿菌和大腸桿菌O157：H7的抑菌率Fig.4 Depression effect of the different density of Sodium benzoate on Listeria monocytogenes，Bacillus cereus，and E.coli O157：H7

2.2 等質(zhì)量濃度的不同防腐劑對(duì)3種食源性致病菌的抑制效果

為了比較天然生物防腐劑與化學(xué)類防腐劑對(duì)3種食源性致病菌的抑菌效果，現(xiàn)將等質(zhì)量濃度的四種防腐劑對(duì)致病菌的抑制率匯總在圖5中。

從圖5A可知，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.01%時(shí)，Nisin對(duì)單增李斯特菌和蠟樣芽孢桿菌的抑制率接近百分之百，但是對(duì)大腸桿菌O157：H7的抑制率只有46.07%，由此可見較低濃度的Nisin依然有效抑制G+菌生長(zhǎng)，而且在此濃度下Nisin對(duì)3種菌的抑菌效果要比其他3種防腐劑理想。相反地，在0.01%濃度下的植酸對(duì)3種致病菌的抑制效果極不理想，而且對(duì)單增李斯特菌和大腸桿菌O157：H7有促生長(zhǎng)作用，分析原因可能是因?yàn)橹菜崾悄軌蚋纳萍?xì)菌細(xì)胞膜對(duì)氧氣的通透性、增加物質(zhì)之間的傳遞性，從而導(dǎo)致了細(xì)菌的快速生長(zhǎng)和繁殖[13]。

圖5 等質(zhì)量濃度的不同防腐劑對(duì)3種食源性致病菌的抑制效果Fig.5 Antibacterial activities of different food preservatives at the same concentration against three species of bacteria

隨著防腐劑濃度的升高，不同防腐劑對(duì)3種致病菌的抑菌趨勢(shì)基本保持一致，抑菌效果最好的是Nisin，其次是苯甲酸鈉、植酸和納他霉素。當(dāng)濃度達(dá)0.1%時(shí)，從圖5D可知納他霉素對(duì)大腸桿菌O157：H7的抑菌率超過了植酸，但是對(duì)其他兩種致病菌的抑菌率依然低于植酸。

3 討論

以上結(jié)果表明，當(dāng)Nisin濃度為0.01%時(shí)，對(duì)單增李斯特菌和蠟樣芽孢桿菌的抑菌率接近百分之百，但對(duì)大腸桿菌O157：H7的抑菌效果較差，當(dāng)Nisin達(dá)最高濃度為0.1%時(shí)，大腸桿菌O157：H7的抑菌率只有61.12%，這結(jié)果也說明了即使Nisin對(duì)G-菌的抑制效果不理想，隨著濃度的增加Nisin對(duì)G-菌的抑制效果將緩慢提高。潘麗軍[10]等在研究Nisin對(duì)G-菌抑制效果的實(shí)驗(yàn)中得出其最小抑菌濃度為5 mg/mL（0.5%），由此可見，只有高濃度的Nisin才能夠有效抑制G-菌的生長(zhǎng)。

雖然苯甲酸鈉的抑菌效果僅次于Nisin，但當(dāng)其濃度達(dá)到最高使用量0.1%時(shí)，對(duì)單增李斯特菌、大腸桿菌O157：H7和蠟樣芽孢桿菌的抑菌率只有66.15%、54.41%和45.19%，并不能很好地抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。在2.1.4也討論了苯甲酸鈉的最低抑制濃度已超過國(guó)家規(guī)定的食品添加劑最大使用量，雖然不同食品中抑菌因素是多方面的綜合效果，但是基于純培養(yǎng)體系的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，不建議單獨(dú)使用苯甲酸鈉作為食品防腐劑應(yīng)用到食品當(dāng)中。

納他霉素是一種對(duì)真菌具有顯著抑制效果的多烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，目前大多數(shù)對(duì)納他霉素的文獻(xiàn)報(bào)道都集中在抗真菌以及酵母菌方面，幾乎沒有關(guān)于納他霉素對(duì)細(xì)菌抑制作用的報(bào)道。因此，本文將納他霉素列為其中一種生物型防腐劑，探究納他霉素對(duì)食源性致病菌的抑菌作用。從2.1.2的試驗(yàn)結(jié)果可得，低濃度的納他霉素對(duì)致病菌幾乎沒有抑制作用，但當(dāng)濃度提高到0.1%時(shí)，納他霉素開始表現(xiàn)出抑制作用。有文獻(xiàn)報(bào)道，納他霉素通過與細(xì)胞膜中甾醇結(jié)合形成一種復(fù)合物，該復(fù)合物能夠改變細(xì)胞質(zhì)膜的性質(zhì)，從而破壞其滲透性及通透性，并達(dá)到抑菌效果[14]。由于細(xì)菌細(xì)胞膜內(nèi)無甾醇，分析本實(shí)驗(yàn)中納他霉素對(duì)致病菌表現(xiàn)出的抑制效果可能是因?yàn)楦邼舛鹊募{他霉素改變了適合致病菌生長(zhǎng)繁殖的環(huán)境條件或者改變了膜內(nèi)外滲透壓，從而抑制住了一部分致病菌的生長(zhǎng)，具體的抑制機(jī)理有待進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論與展望

試驗(yàn)結(jié)果表明，4種防腐劑中Nisin對(duì)致病菌的抑菌效果最好，其中對(duì)單增李斯特菌和蠟樣芽孢桿菌的最小抑制濃度為0.01%，但無法得到對(duì)大腸桿菌O157：H7的最小抑制濃度，達(dá)最高濃度0.1%時(shí)的抑菌率只有61.12%；在濃度范圍0.01%～0.05%，納他霉素和植酸對(duì)致病菌的抑制效果并不理想，其中納他霉素基本對(duì)致病菌無抑制作用，當(dāng)兩者濃度提高到0.1%時(shí)，對(duì)致病菌的抑制作用有明顯的提升；苯甲酸鈉的抑菌效果僅次于Nisin，但無法在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)得出對(duì)3種致病菌的最小抑菌濃度。綜合上述結(jié)論，納他霉素、植酸和苯甲酸鈉在單獨(dú)使用的情況下無法達(dá)到抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的目的，因此下一步工作可將其復(fù)配并應(yīng)用于真實(shí)食品樣品中進(jìn)行驗(yàn)證。

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