不同酵母種類及添加方式對甜面醬風味的影響

王從從 ，石磊 ，萬守朋 ，王艷玲 ，韓麗榮 ，王春玲

（1.天津市利民調料有限公司，天津300308；2.天津科技大學食品工程與生物技術學院，食品營養與安全教育部重點實驗室，天津300457）

甜面醬，主要制作原料是面粉或小麥，是經制曲、保溫發酵釀造而成的一種具有特殊風味的醬類食品，具有咸中帶甜的特征性味道[1]。最近，已經有許多加速生產發酵食品和縮短發酵過程的方法見諸報道，據報道，發酵劑已用于提高許多發酵食品的質量[2-3]。酵母菌主要在發酵階段開始作用，其作用主要是產醇類和其他少量的風味物質。酵母菌發酵產生的醇類物質和細菌發酵產生的有機酸在酯化酶的作用下通過縮合反應生成酯類物質，形成醬制品風味成分的主體[4]。

本研究在發酵期間添加不同酵母，跟蹤測定添加不同酵母的基質發酵過程中的理化指標，分別測定發酵第30天和第45天添加不同酵母的醬醪的有機酸含量和揮發性風味物質組成，并結合感官評價，選出更適合新型甜面醬發酵的酵母種類、添加方式和發酵周期。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

面粉（標準粉）、大豆分離蛋白粉（食品級）和食用鹽均為市售；米曲霉3.042、魯氏酵母（S酵母）和球擬酵母（T酵母）均來自于天津科技大學菌種保藏中心。

1.2 種曲的制備

從米曲汁斜面培養基上挑取3環～4環米曲霉3.042孢子，接種至冷卻至30℃左右的錐形瓶種曲培養基中，當整體培養約40 h左右，觀察種曲表面整體全部變為黃綠色，于60℃的條件下干燥約4 h后裝入牛皮紙袋中備用。

1.3 大曲的制備

在原料中加入總質量的30%的水，121℃滅菌15 min～20 min后接入為原料質量3‰的種曲，于30℃生化培養箱中培養40 h后，待曲料變為均勻的黃綠色，說明曲料成熟。

1.4 甜面醬的制備

在原料質量配比為面粉∶大豆分離蛋白粉=9∶1的基礎上制作甜面醬，制曲時間為40 h，采用前期42℃高溫發酵10 d，后期30℃低溫發酵工藝，在第10 d發酵溫度變為30℃時，添加酵母，接種量均為106個/mL醬醪，本階段的研究設計了5個發酵組，分別為添加S酵母組、添加T酵母組、先S酵母后T酵母組、先T酵母后S酵母組和不添加酵母的空白組，混合型酵母添加組中兩種酵母的添加時間相差10 d。跟蹤甜面醬發酵基質的總酸、pH值、氨基酸態氮和還原糖含量這4個理化指標的變化，并分別對發酵過程第30天和第45天的基質的有機酸和揮發性風味物質測定分析及感官評價，來決定酵母的添加種類、添加方式以及發酵周期。

1.5 甜面醬原料配比的優化

總酸、pH值、氨基酸態氮和還原糖含量測定：按照國標GB/T 5009.39-2003《醬油衛生標準的分析方法》；有機酸含量、揮發性風味物質測定：按照參考文獻[5]的方法進行測定。采用九分嗜好評分法分別對甜面醬基質醬進行色澤、醬香味、酯香味、醇厚感、回甜和體態這6個方面的可接受度進行喜好評分，來判定甜面醬基質的整體可接受度。1到9分別代表極度不喜歡、非常不喜歡、適度不喜歡、輕微不喜歡、既不喜歡也不討厭、輕微喜歡、適度喜歡、非常喜歡、極度喜歡。參評人員由10名經過培訓課程的研究生和博士生組成。

2 結果與討論

在醬制品的工業中也很少人工接種酵母菌，主要采用自然接種方式。用于提高和加快醬制品風味物質形成的耐鹽產香酵母主要有T酵母（易變球擬酵母）、S酵母（魯氏酵母）和C酵母（假絲酵母）3大類，在生產的特定時期添加不同的耐鹽產香酵母對醬制品風味的影響有所不同[6-7]。耐鹽產香酵母的添加可以顯著地增加用米曲霉發酵釀造醬制品的風味物質種類和數量，提升醬制品質量。

甜面醬的獨特風味是由甜面醬中種類各異、數量不同的風味物質綜合作用于人體感官的結果[8]，包括香氣和滋味兩個方面[9]，其中香氣由食物中各種揮發性物質綜合產生，這部分物質大致有酯類、醇類、醛類、酚類、含氮成分、雜環成分等等；滋味由食物中各種非揮發性成分綜合產生，這部分物質的分子量一般較高，可分為含氮成分（如游離氨基酸，核苷酸和有機堿）和不含氮成分（有機酸、糖和無機成分）。風味物質一般具有種類多、含量微、熱穩定性差等特點[10]，但風味物質對食品的品質有較大影響。甜面醬的獨特風味是由復雜的揮發性風味物質混合交織形成，這些成分通常在甜面醬中占據較小的比例，而且平均由幾十種混合物構成甜面醬的風味組成。所以，分離鑒定甜面醬中特征性的風味成分不僅可以了解其化學組成，還可以模擬甜面醬的風味組成。

2.1 理化指標的測定

2.1.1 總酸和pH值的跟蹤測定

在發酵過程中影響醬制品總酸含量變化最主要的原因是蛋白質經蛋白酶水解后生成含有羰基的多肽和氨基酸。醬制品的pH值變化與總酸含量變化相關。發酵過程中，酵母菌、乳酸菌和其他微生物生長繁殖都會造成醬醪的pH值下降，到了發酵后期，醬制品pH值會下降并維持在5.0左右，pH值的變化可以從側面反映醬制品的發酵狀態是否正常。

2.1.1.1 總酸含量的測定

添加S酵母組、添加T酵母組、先S后T組、先T后S組和不添加酵母的空白組5個發酵組的總酸變化趨勢如圖1。

圖1 發酵基質中總酸含量的動態變化Fig.1 The dynamic curve of total acid content in the fermentation medium

由圖1可以看出，5個發酵組的總酸含量總體均呈現隨發酵時間的延長而逐漸升高的趨勢，且在前30 d總酸含量上升趨勢比較明顯，之后趨于平緩。從發酵終端可以看出，添加T酵母組和先T酵母后S酵母組使得醬醪的總酸含量上升比較明顯，添加S酵母組和先S酵母后T酵母組對總酸含量影響較不添加酵母的空白組不大，尤其先S酵母后T酵母組并沒有體現出相對添加單一酵母的發酵組有優勢。

2.1.1.2 pH值的跟蹤測定

添加S酵母組、添加T酵母組、先S后T組、先T后S組和不添加酵母的空白組五個發酵組的pH值變化趨勢如圖2。

圖2 發酵基質pH值的動態變化Fig.2 The dynamic curve of pH of the fermentation medium

由圖2可以看出，5個發酵組的pH值在發酵初期均呈現出了快速下降，隨后趨于穩定的趨勢，而且發酵終端酸度相差不大，整個發酵過程中醬醪的pH值都被在合理的范圍內，說明五個發酵組的發酵狀態均正常。

2.1.2 氨基態氮含量的跟蹤測定

添加S酵母組、添加T酵母組、先S酵母后T酵母組、先T酵母后S酵母組和不添加酵母的空白組5個發酵組的氨基態氮含量變化趨勢如圖3所示。

圖3 發酵基質中氨基酸態氮含量的動態變化Fig.3 The dynamic curve of amino nitrogen content in the fermentation medium

由圖3可以看出，在發酵過程的前12天內，添加酵母的4個發酵組中的氨基態氮含量均呈現快速上升的趨勢。第12天之后添加酵母的4個發酵組氨基態氮含量出現了短暫的下降。另外在第30天兩個混合酵母發酵組第二次引入另外一種酵母后，兩個酵母組同樣經歷了短暫的下降后又趨于平緩的上升。

從發酵終端可以看出，添加T酵母組的氨基酸態氮含量較高，5個發酵組的氨基態氮含量都明顯高于甜面醬的國家標準氨基態氮含量（g/100 g）≥0.3 g/100 g。T酵母的添加使得醬醪的氨基態氮含量上升最為明顯，兩個混合酵母發酵組的氨基態氮含量相差不大，比添加S酵母發酵組略高。

2.1.3 還原糖含量的跟蹤測定

還原糖是指所有能還原斐林試劑的糖，包括全部的單糖以及大部分的二糖，發酵過程中原材料中的淀粉物質在淀粉酶和糖化酶的作用下可以逐步分解為還原糖，而發酵環境的變化會導致醬醪中淀粉酶和糖化酶的作用活躍程度，因此導致了醬醪中還原糖的變化。

添加S酵母組、添加T酵母組、先S酵母后T酵母組、先T酵母后S酵母組和不添加酵母的空白組5個發酵組的還原糖含量變化趨勢如圖4所示。

圖4 發酵基質中還原糖含量的動態變化Fig.4 The dynamic curve of reducing sugar content in the fermentation medium

由圖4可以看出，在發酵過程的前15天內，5個發酵組基質中的還原糖含量均呈現平緩上升的趨勢，這是由于原料中的淀粉等物質在淀粉酶和糖化酶等酶類的作用下水解生成葡萄糖和麥芽糖等還原糖。此后，除不添加酵母的空白組繼續呈上升趨勢，而添加了酵母的發酵組的還原糖含量均開始下降。另外，添加T酵母組和先T酵母后S酵母組的下降更快，說明T酵母能更有效地利用發酵過程的葡萄糖。發酵進入到后期，基質的環境發生變化，越來越不利于微生物的生長，導致微生物消耗還原糖的能力下降，因此還原糖的含量下降趨于緩慢。

從發酵終端可以看出，5個發酵組的還原糖含量均符合甜面醬的國家標準還原糖含量（g/100 g）≥20 g/100 g。

2.2 有機酸含量的測定

有機酸對醬制品呈香、呈味有較大的促進效果。如乙酸對醬制品的香氣具有較大的貢獻，能顯著改善醬制品的口感和風味[11]。有機酸本身具有滋味，同時是形成酯香味的基礎[12]。9種有機酸混合標準溶液液相色譜圖見圖5。

圖5 9種有機酸的混合標準溶液液相圖譜Fig.5 Chromatograms of mixed standard solution of nine organic acids

發酵周期分別為30 d和45 d的甜面醬基質，5個發酵組中有機酸檢測的結果如表1和表2所示。

表1 發酵30 d 5個發酵組中有機酸含量的比較Table 1 Content of the organinc acids in five kinds of essential matrix after fermentation for 30 days g/100 g

表2 發酵45 d 5個發酵組中有機酸含量的比較Table 2 Content of the organinc acids in five kinds of essential matrix after fermentation for 30 days g/100 g

由表1可以看出，發酵周期為30 d時，5個發酵組均檢出6種有機酸，添加酵母的四個發酵組檢出的有機酸種類與空白組相同，添加酵母的發酵組的酒石酸含量增加最為明顯，添加T酵母發酵組和先T酵母后S酵母組含量較高。酒石酸是一種羧酸，存在于多種植物中，如葡萄和羅望子，也是葡萄酒中主要的有機酸之一，作為食品中添加的抗氧化劑，可以使食物具有酸味。乙酸含量也略有提高，乙酸是由乙醇氧化得來的，具有調和口感和風味的作用，對醬類產品的香氣具有較大的貢獻。富馬酸含量也有所增加，同樣是添加T酵母發酵組和先T酵母后S酵母組含量較高，富馬酸是一種食品添加劑，可以增強食品的風味。

由表1和表2可知，發酵周期為45 d時，5個發酵組均檢出6種有機酸，乙酸和富馬酸含量上升，檸檬酸含量除添加S酵母組外均上升，添加T酵母發酵組和先T酵母后S酵母組上升明顯。乳酸含量雖然略有下降，但是幅度不大，較整體有機酸的種類和含量增加而言，影響不大，不會對基質的風味造成太大影響。總體看來，有機酸的種類和含量在添加T酵母發酵組和先S酵母后T酵母組中更有優勢，發酵周期為45 d時比發酵周期為30 d時更有優勢。

2.3 揮發性風味物質的測定

發酵周期分別為30 d和45 d的甜面醬基質揮發性風味物質的種類測定結果如表3所示。揮發性風味物質的種類和相對含量分析如表4所示。

表3 5個發酵組檢測到的揮發性風味物質分析Table 3 Analysis of flavor substance in the five kinds of essential matrix

表4 5個發酵組檢測到的揮發性風味物質分析Table 4 Attached table 1 Analysis of flavor substance in the five kinds of essential matrix

續表4 5個發酵組檢測到的揮發性風味物質分析Continue table 4 Attached table 1 Analysis of flavor substance in the five kinds of essential matrix

續表4 5個發酵組檢測到的揮發性風味物質分析Continue table 4 Attached table 1 Analysis of flavor substance in the five kinds of essential matrix

由表3和表4可知，添加了酵母的4個發酵組所檢出的酯類數量和相對含量都遠遠的多于未添加酵母的發酵組，說明酵母的添加明顯改善了甜面醬基質酯類的構成。其中添加T酵母發酵組和先T酵母后S酵母發酵組的影響更明顯，發酵周期30 d和45 d的數量都相對其他組略多。從酯類的組成方面可以看出，乙基酯的數量占據絕大多數，這些乙基酯大多呈果香，氣味強度適中，溫和厚重，是甜面醬香味的底蘊。各組在發酵周期為30 d和45 d時檢出的醇類物質的種類變化不大，各個發酵組的區別也不大。相對含量方面，空白組和S酵母組中均下降，其他3個組中均升高，其中苯乙醇的含量在空白組和S酵母組中下降明顯，在其他3個組中均升高，在T酵母組中含量最多，在混合酵母發酵組中相差無幾。

醛類物質在T酵母組和先T酵母后S酵母組中數量較少，發酵周期為45 d時較發酵周期30 d時下降，其他組別沒有變化。在5個發酵組中都檢出苯甲醛和苯乙醛，二者均為醬類制品中香氣的關鍵組成部分。各個發酵組中酸類數量不多且相差不大，發酵周期為45 d較發酵周期30 d時，空白組和S酵母組的數量下降，T酵母組和先S酵母后T酵母組未變，先T酵母后S酵母組上升。含量各組相差不大。在T酵母組中未檢出異戊酸，異戊酸的氣味難聞，會刺激呼吸道和食道。酚類物質在各發酵組中數量較少，發酵周期為45 d時較發酵周期30 d時下降。

綜上，對5個發酵組特征性風味物質的分析，結果表明添加酵母對甜面醬特征性風味物質的形成有積極影響，其中先加T后加S組影響更明顯，發酵周期為45 d時，先加T酵母后加S酵母組的各類揮發性風味物質較發酵周期30 d時有優勢。

2.2.4 感官評價結果

采用九分嗜好評分法分別從色澤、醬香味、回甜、酯香味、醇厚感以及體態這6個方面來判定甜面醬基質的整體可接受度。發酵周期為30 d和45 d的基質終端感官評價結果見圖6。

圖6 添加不同酵母發酵30 d和45 d基質感官評價Fig.6 The sensory evaluation in essential matrix with different yeasts ferment 30 days and 45 days

添加不同酵母發酵30 d的甜面醬基質的各項得分較空白組有所高，先T酵母后S酵母組在其他各項指標得分均不低于其他組別的情況下，醇厚感的得分尤為突出。

對發酵45 d的甜面醬基質進行感官評價，與30 d時對比得出，先T酵母后S酵母組在其他各項指標得分均不低于其他組別的情況下依舊較其他組別有優勢，且醇厚感得分比發酵30 d時增加。因此，結合理化指標、對有機酸的分析和對揮發性風味物質的分析，在新型甜面醬基質的發酵過程中，先加T酵母后加S酵母，發酵45 d，能制作出風味更好的甜面醬。

3 結論

本文采用不同酵母種類及添加方式，結果表明添加T酵母發酵組和先T后S酵母發酵組使得還原糖的利用更充分，發酵終端基質的總酸和氨基酸態氮含量更高，其他理化指標也較合理，基質發酵終端有機酸和揮發性風味物質的分析。添加酵母對甜面醬的有機酸含量和特征性風味物質的形成有積極影響，其中先T后S組影響更明顯，發酵周期為45 d時，先T后S組的有機酸含量和各類揮發性風味物質較發酵周期為30 d時有優勢。感官評價結果表明：添加酵母組的各項得分較空白組有所提高，先T后S組在其他各項指標得分均不低于其他組別的情況下，醇厚感的得分尤為突出。發酵45 d的甜面醬基質進行感官評價，與30 d時對比得出，先T后S組在其他各項指標得分均不低于其他組別的情況下依舊較其他組別有優勢，且醇厚感得分比發酵30 d時增加。因此，在新型甜面醬基質的發酵過程中，先加T酵母后加S酵母，發酵45 d，能制作出風味更好的甜面醬。本實驗僅研究了加入不同的酵母進行發酵對甜面醬成品有機酸和揮發性風味物質的影響，可在后期研究中增加對游離氨基酸的檢測。

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