食源性致病菌生長異質性對風險評估的影響

盧 奕 劉海泉,2,3,4 趙 勇,2,3 謝 晶,2,3 潘迎捷,2,3

(1. 上海海洋大學食品學院，上海 201306；2. 上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海 201306;3. 農業部水產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室﹝上海﹞，上海 201306;4. 上海海洋大學食品熱加工工程技術研究中心，上海 201306)

2017年10月世界衛生組織 (World Health Organization，WHO)發布的食品安全風險分析[1]指出，含有有害細菌、病毒或化學物質的食品可導致腹瀉、急性胃腸炎等200多種疾病，據估計每年全世界有6億人因食用受污染的食品而患病，死亡人數達42萬人；在中國，致病微生物是引起食源性疾病的首要因素，其中又以食源性致病菌最為多見[2]。為減輕食源性疾病對人類健康和社會的影響，從2002年開始，WHO不定期發布了一系列《世界衛生組織全球食品安全戰略》[3]并在全球積極推行；中國為實施好食品安全戰略，加強食品安全治理，國家食品藥品監督管理總局發布了“十三五”國家食品安全規劃，強調了全面了解各類食品中微生物和致病菌污染狀況，確定其分布及來源的重要性。因此，科學、客觀、準確地評估食品當中的危害因素對人體造成健康損害的概率，是目前由食源性致病菌導致的食品安全問題有待研究和攻克的熱點及難點問題。

科學證明風險分析技術是評價食物鏈中危害與人體健康風險相關性的首選方法，風險評估則是風險分析框架中的科學核心；而微生物風險評估是食品安全風險評估的主要組成部分，同時也是廣泛應用的控制食源性疾病的重要科學手段。但是，由于微生物廣泛存在的菌株異質性，即使外界條件相同，同一菌株生長情況也存在差異，因此，當下中國大多以單一典型菌株的生長/失活模型為基礎進一步建模的微生物風險評估，往往存在夸大或降低食源性致病菌在食品中的真實風險等問題，最終造成不必要的經濟損失，甚至一系列食品安全問題[4]。本文綜述了幾種典型食源性致病菌生長異質性對微生物風險評估的影響，以期借此為中國更科學地開展風險評估提供理論依據。

1 微生物異質性

同一微生物即使在實驗室中通過單克隆培養后，最終群體中的每個細胞間都可能在遺傳、生理和生長行為等方面表現出廣泛的差異性，這種現象被稱為微生物異質性(Microbial Heterogeneity)[5-7]。異質性是微生物在復雜多變的環境中生存的一種策略，在表型和遺傳等方面表現差異，使微生物在一定的生存環境中選擇特定的生存方式(與生存環境的變化協調一致)，從而表現出該微生物的多樣性；而生長行為表現出的差異，稱之為生長異質性[8-9]。

從不同環境和食品中分離到的微生物其耐藥性、菌株生長特性等具有顯著的差異，屬于典型的菌株表型異質性[10-12]；即使同一菌株，其毒力和致病性也是存在差異的，且具有多樣性，同時其在不同環境條件下表現出不同的生長速率、生物被膜生長能力以及不同的耐藥性等，表現出菌株具有很大的異質性，從而對環境產生不同的適應和抗性[13-15]。

2 食品微生物風險評估

2.1 風險評估概況

國外較早開展了食品中致病微生物風險評估工作，且評估方式、內容、領域等較全面；總體來說，目前國外食源性致病菌風險評估的研究主要集中在如何準確地進行定量評估，對于暴露評估完整過程及相應模型的建立等方面的研究較為深入[16-17]，但菌株生長模型是用以前根據單一菌株構建的簡單模型，近年才開始關注菌株異質性對風險評估的影響[10,15]。在中國，由于各種條件的限制，使得評估內容及應用價值存在一定的局限性：首先中國一些定量風險評估文章依然停留在簡單的點估計、區間估計評估階段，這種方法常常產生“敏感反應卻不能夠被排除”的結論，給風險決策帶來很大障礙，同時參數的變異性及不確定性也暫時尚未納入考慮范疇[18-19]；其次，風險評估內容采用的菌體生長模型參數大多為國外權威機構(如FDA、WHO、FAO)、研究所等研究獲得的數據，大多數據未經驗證直接使用[20]，但是由于國內外地理位置、氣候條件、飲食及風俗習慣等差異，國外各參數值未必能很好地描述國內環境對微生物生長的影響狀況。

2.2 菌株生長異質性對風險評估的影響

2.2.1 李斯特菌生長異質性 20世紀80年代，Rosenow等[21]研究發現不同介質(脫脂奶、全脂奶、巧克力奶和奶油)、不同溫度(4，8，13，21，35 ℃)條件下，單增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)代時及最大菌落數存在差異，至此食源性致病菌生長異質性問題引起部分學者的關注[22-23]。Begot等[24]選取了64株不同分離來源及不同血清型的李斯特菌，在不同的溫度(10～37 ℃)，水分活度(0.96～1.00)及pH值(5.6～7.0)條件下進行培養試驗，利用Gompert函數擬合，結果表明分離來源自工業用地的菌株生長速率更快且菌落形態更聚集，提出了菌株生長異質性對定量風險評估結果準確性存在影響這一問題。

通過二次建模、引入相關變異系數，在一定程度上能降低食源性致病菌生長異質性對微生物風險評估的影響。Pouillot等[25]對牛奶中李斯特菌進行了相關研究，通過貝斯方法進行二次建模，首先建立logistic方程作為初始增長模型，然后建立基數溫度方程作為二次增長模型，以此減弱菌株的生長異質性對微生物風險評估中變異性和不確定性的影響。Aryani等[26]選取了20株單增李斯特菌定量分析了菌株異質性對最大比生長速率的影響，結果表明，當4個主要生長參數pH(min)為4.5(4.4～4.7)，NaCl濃度為2.0 mmol/L (1.8～2.1)，乳酸濃度為 5.1 mmol/L (4.2～5.9)，溫度為-2.2 ℃ (-3.3～-1.1)，符合現有文獻中的平均生長速率，而在該研究選取的參數區間下，得到菌株間生長速率差異為2～4 lg (CFU/mL)，強調了獲取特定條件下的變異系數對實際預測微生物生長動力學的重要性。

食源性致病菌生長異質性主要表現為延滯期、指數生長期、生長速率、傳代時間及生長極限等生長特性的異質性。Barbosa等[27]通過分光光度計測定菌懸液在600 nm處的吸光值，研究不同溫度(4，10，37 ℃)下，單增李斯特菌在延滯期、指數生長率和傳代時間等方面表現出的差異，結果表明，39株單增李斯特菌的生長行為表現出不同程度的菌株異質性。Koutsoumanis等[28]比較研究6株的李斯特腸炎病原菌，在不同的鹽濃度(0.5%～8%)和pH值(5.0，5.5，7.3)的生長極限的差異。結果表明，隨著NaCl濃度的增加和pH的降低，能夠生長和形成菌落的細胞數量逐漸減少，證實了單個細胞生長極限存在變異性。同時，還提出了“偽滯后”的概念，指在接近生長極限時，種群中非增長部分的存在導致了細菌總量增長延遲，“偽滯后”的程度取決于外界環境，而單個李斯特菌變異性則受接種量和生長條件的共同影響。

外界環境對食源性致病菌異質性存在影響。Augustin等[29]選取了不同生產廠商、同一生產廠商不同生產批次5種食品：真空包裝的豬肉餡餅、真空包裝的煙熏鯡魚、常壓氣調包裝的切片火腿、煮熟的雞肉以及魚糜沙拉，在同一培養條件下，對其中的單核細胞增生李斯特菌生長異質性變異系數(CV)進行了量化，結果顯示，5種食品中單核細胞增生李斯特菌的CV差異很小，但同一生產廠商不同生產批次的食品中單核細胞增生李斯特菌CV約為20%，而不同生產商生產的同一種食品中單核細胞增生李斯特菌CV約為35%，因此，認為食品的自身質構狀態對單核細胞增生李斯特菌生長異質性的影響很小；但同一生產商不同批次或不同生產廠商等均對李斯特菌的生長異質性影響較大。Avery等[30]發現臨床分離的單增李斯特菌，比豬肉中的分離株具有更短的延滯期；此外，在4 ℃饑餓條件下進行處理后，臨床分離株與豬肉分離株的延滯期異質性更為明顯。

2.2.2 副溶血性弧菌生長異質性 生長環境(溫度、是否純培養)對食源性致病菌的生長異質性存在影響。唐曉陽等[31]研究了不同溫度下9株致病性與非致病性副溶血性弧菌最大比生長速率之間的差異，結果顯示15，20，25 ℃下，其變異系數分別為20.72%，17.5%，15.98%，不同副溶血性弧菌的最大比生長速率之間的差異隨著溫度的降低而增加。Ma等[32]選取了4株致病性副溶血性弧菌，在15～30 ℃條件下，利用Gompertz、Baranyi和 Logistic模型研究單一菌株和混合菌株的生長狀態，結果顯示，混合菌株的生長速率比單菌株的大，延滯期比單一菌株的短。

外部因素(溫度、鹽度)及內在因素(毒力基因型)對食源性致病菌的生長異質性存在影響。郭丹鳳等[12]研究表明不同耐藥性致病性副溶血性弧菌菌株在 20，25，37 ℃下其最大比生長速率(μmax)、延滯期(λ)及最大生長量(Nmax)存在一定的差異性，12 ℃下不同的致病性副溶血性弧菌菌株在不同生長基質中的生長動力學參數存在較大差異。而在12，35 ℃下，血清型為 O3:K6 的致病性副溶血性弧菌在南美白對蝦中的最大比生長速率均大于同類研究中的致病副溶血性弧菌在培養基和三文魚中的。Liu等[33]選取了50株不同分離來源(海水來源，淡水來源)及不同基因型(tlh+/tdh+/trh-、tlh+/tdh-/trh+和tlh+/tdh-/trh-)的副溶血性弧菌，測定菌株的最大比生長速率，結果表明，當溫度和鹽度越不適宜時，菌株生長異質性越明顯，且溫度對菌株異質性的影響更大；此外，淡水水產品中分離得到的菌株比海水中分離得到的菌株生長情況差異更明顯，帶有致病基因tdh的菌株比不帶有該致病基因菌株的生長異質性更大。

2.2.3 沙門氏菌生長異質性 血清型是影響食源性致病菌生長異質性的另一內在因素。Díez-García等[34]通過構建生長曲線，對比研究69株沙門氏菌共10個血清型的生長動力行為(延滯期和生長率)差異，結果表明不同血清型沙門氏菌之間存在生長異質性。

生長條件(溫度、pH及鹽度)越不適應于菌株生存，菌株之間的生長異質性越大。Fehlhaber等[35]通過肉湯培養的方法，在7～42 ℃下評估從食品中分離的沙門氏菌的生長異質性，研究表明，當環境溫度逐漸偏離最適生長溫度時，45株沙門氏菌生長異質性明顯增大。Lianou等[36]選取了60株沙門氏菌，在不同的pH值、鹽度條件培養下，通過構建一級模型分析了菌株生長異質性，其變異系數分別為：6.1%(0.5% NaCl，pH 7.0)，11.8%(0.5% NaCl，pH 4.3)和23.5%(6.0% NaCl，pH 7.0)，說明菌株之間存在顯著的生長異質性，且環境條件越惡劣，菌株生長變異性越強；鹽度的生長異質性大于pH值的。

在之前的基礎上，Lianou[37]將種內生長變異納入考慮的范疇，檢測60株沙門氏菌在pH(4.0～7.0)及Aw(0.964～0.992)的最大比生長速率，其中pH采用基樣條插值公式法，Aw則采用γ概念模型，統計pH(min)、pH(opt) 及Aw(min)的累計概率，并通過Monte Carlo擬合，最后確定取pH 5.0、Aw 0.977對原始的生長模型進行了改進，一定程度上提高了沙門氏菌生長異質性導致隨機建模方法在描述和定量微生物學及微生物風險評估的準確性。

2.2.4 其他食源性致病菌生長異質性 pH、水分活度(Aw)及菌株分離來源對食源性致病菌生長異質性也存在一定影響。Haberbeck等[38]選取了188株大腸桿菌菌株，研究在不同溫度(20，25，30 ℃)，不同pH及是否有其他菌株存在的情況下(pH 3.8，3.9，4.0，4.1，4.2，4.3無乳酸菌；pH 4.3，4.4，4.5，4.6，4.7，4.8含25 mmol/L 乳酸菌)大腸桿菌的生長異質性，結果表明，pH對大腸桿菌生長異質性的影響顯著高于其他兩個因素，140個菌株(約75%)在低pH條件下表現出明顯的生長異質性，而20個菌株(約11%)在高pH條件出現明顯的生長異質性。Garcia等[39]關于曲霉菌生長異質性研究中，發現菌株在相同溫度(25 ℃)不同水分活度(0.90，0.98)條件下，菌株生長異質性變異系數CV明顯不同；而在相同水分活度(0.98)不同溫度(25，37 ℃)條件下，最大菌株生長速率差異高達4倍。Topp等[40]對農業土壤中的大腸桿菌菌株間的生長異質性進行研究，結果表明土壤環境等對其生長異質性也存在影響。

除了以上列出的食源性生長異質性的研究實例之外，產氣莢膜梭菌、蠟狀芽孢桿菌和葡萄球菌[41-42]的生長異質性也有一定的研究，研究結果一致指出，傳統建模時常用單一菌株的生長數據構建模型，進行微生物食品安全風險評估，往往與實際情況存在較大的誤差。因此，建立預測微生物動力學模型和微生物風險評估中，在充分考慮菌株異質性的基礎上，進一步將菌株生長環境、菌株來源和基因型納入考慮的范疇[27-28]。

3 展望

為有效預防和控制食品中致病菌引起的食品中毒，國內外開展了相關致病菌的風險評估研究[43-44]。食源性致病菌生長異質性主要表現為延滯期、指數生長期、生長速率、傳代時間和生長極限等菌株生長特性的差異[45-48]。通過總結以上一系列研究發現，食源性致病菌生長異質性對微生物的風險評估有顯著的影響：① 從不同環境中分離到的致病菌普遍存在典型的菌株表型異質性，即菌株間的耐藥性、生長特性等具有顯著差異[10-12,49-50]；② 溫度、鹽度、pH值及是否為純培養等外界因素，血清型、毒力基因型等內在因素，均會對所選取的典型菌株生長情況產生不同程度的影響；③ 同一生產廠商僅僅生產批次不同的食品中，微生物的分布及生長情況也存在差異。這就意味著，即使外界條件基本一致甚至完全相同時，典型菌株生長情況的差異性仍然存在，僅通過單一典型菌株來構建的生長模型，仍不能做到客觀準確地反映食品中微生物的真實存在情況。但目前，國內外就菌株生長異質性對風險評估的影響這一問題關注不多。

由于微生物生長繁殖易受環境影響，因此，菌株生長異質性無疑給實際生產生活中微生物風險評估增加了難度[51]；此外，由于試驗環境和實際生產環境的差異，實驗室測得的菌株生長異質性變異系數CV與實際生產中該菌株CV之間的差異，及如何準確測定CV值得進一步探究。微生物風險評估食品安全應充分考慮菌株異質性，來構建更科學的菌株生長/失活模型；同時在暴露評估中，充分考慮菌株異質性，通過完善檢測手段來更正確描述食品中致病菌的存在情況(致病能力、數量和檢測概率)準確分析食品中致病菌的存在情況，構建純培養和食品中致病菌生長異質性大數據庫，獲得菌株生長異質性變異系數CV，構建基于CV參數的微生物定量風險評估宏模型(Metamodel)，進一步建立基于中國國情的微生物風險評估修正模型；因此充分考慮菌株異質性對微生物風險評估的影響，以期待更科學的預報預防食品中致病菌的風險，降低對消費者的威脅和經濟損失，將為提升風險評估理論、科學開展風險評估提供支撐。