依布硒啉通過Akt/eNOS通路對心肌缺血再灌注損傷的保護作用

翟昌林，錢 鋼，胡惠林，唐關敏

(嘉興市第一醫院 心內科，浙江 嘉興 314000)

心肌缺血后血流恢復對缺血區的供應稱為缺血再灌注，但在再灌注過程中同樣會造成心肌細胞的凋亡，這一過程稱為I/R，即缺血再灌注損傷(I/R)[1]。缺血再灌注損傷通常發生在一些臨床上對急性冠脈綜合征的一些干預過程中，例如溶栓，支架介入或者心臟移植手術。相關研究顯示AKT通路調節了哺乳動物細胞的大部分應答，在I/R過程中AKT通路的激活可抑制細胞的凋亡并激活存活路徑[2]。依布硒啉是一種具有很好的過氧化物酶作用的有機硒化合物，研究報道依布硒啉可通過抗氧化作用，抑制氧自由基的生成積累，減少脂質過氧化作用來抑制心肌細胞凋亡[3]。然而在I/R過程中依布硒啉是否通過AKT/eNOS通路發揮再灌注缺血損傷保護作用及其具體機制仍未知，本文以此為出發點進行相關研究。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 鼠齡8周雄性SD大鼠30只，體質量240～260g，充足食水，在21±2℃的環境中飼養，由浙江大學實驗動物中心提供；TUNEL檢測試劑盒、NO檢測試劑盒購自Roche，TNF-α、Caspase-3、磷酸化AKT/eNOS的兔多克隆抗體均購自Abcam，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG抗體均購自Roche，依布硒啉購自美國cayman生物公司。

1.2 大鼠心肌再灌注模型建立 參照Zeng XC等[4]文獻中方法：3%的戊巴比妥鈉以30mg/kg進行腹腔注射，麻醉后固定于手術臺面，行氣管切開，接呼吸機維持呼吸，右頸動脈插管進入左心室采集心功能相關參數，于胸骨左緣心尖搏動最強處行縱形切口，鈍性分離皮下組織，剪開心包暴露心臟，以左冠狀靜脈為參照，于肺動脈圓錐右側，鑷子提撥起左心耳，左心耳下緣1.5mm處用線穿過，連同硅膠管一起結扎，結扎冠狀動脈至無血流通過1h，松開冠狀動脈結扎，再持續灌注2h，即完成心肌缺血再灌注損傷模型的建立。結扎后心電圖II導聯ST段呈弓背向上抬高大于0.1mv，QRS波變寬振幅擴大，心肌顏色變灰白為阻斷成功標志，造模成功后即刻采集心功能各項參數后再通過頸動脈采血提取血液樣本1mL，術后即刻頸椎脫臼法處死各組大鼠并摘除心臟，術中死亡大鼠不記入實驗。

1.3 動物分組 30只SD大鼠隨機分為3組，每組10只。假手術組：手術過程中穿線但不予結扎，術前1 min腹腔推注生理鹽水2mL；缺血再灌注組：結扎1 h，再灌注2 h，術前10 min腹腔注射生理鹽水2 mL；依布硒碄組：結扎1 min，再灌注2 h，術前10 min以5mg/kg的劑量腹腔推注依布硒啉。

1.4 心功能的測定 造模成功后即刻通過壓力-體積導管(1.9 F；Scisense儀器，安大略，加拿大)記錄并計算左室收縮末期壓力(LVESP)、左室舒張末期壓力(LVEDP)，和每搏功(SW)，收縮末期壓力-容積關系(ESPVR)和舒張末期壓力-容積關系(EDPVR)。

1.5 TUNEL監測心肌細胞凋亡情況 再灌注結束后，摘除各組大鼠心臟，石蠟包埋切片，將標本用二甲苯透明，乙醇脫水后PBS漂洗2次，Proteinase K工作液去除組織蛋白；各組組織分別加對應的50μL TUNEL檢測液，待玻片干后，加50μL TUNEL反應混合液，37℃暗濕盒中孵育60 min，PBS漂洗3次；于熒光顯微鏡下計數凋亡細胞；待干后加50μL converter-POD，暗濕盒中37℃反應30min。PBS漂洗3次；在組織處加50～100μL DAB底物，反應15～25℃×10min；PBS漂洗3次；拍照后再用蘇木素復染，幾秒后立即用自來水沖洗。梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。加一滴PBS或甘油在視野下，用光學顯微鏡進行計數(100～200個細胞)并拍照。

1.6 各組心肌Akt/eNOS磷酸化情況及TNF-α、Caspase-3蛋白表達 再灌注后摘除每組大鼠心臟，于冰上對心肌組織裂解取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，提取100 μg的心肌組織蛋白于12% SDS-PAGE凝膠上，電泳分離蛋白轉移至聚偏氟乙烯膜，5%脫脂奶封閉后在膜中加入目標蛋白(Akt、p-Akt、NOS、eNOS、TNF-α、Caspase-3)相對應的稀釋后的一抗，常溫孵育2 h，TBST洗脫3次后加1∶5000稀釋的HRP標記的二抗封閉，孵育60min，ECL化學顯色發光。通過Quantity one圖像分析軟件對各組條帶亮度值進行分析計算。

1.7 NO測定 再灌注后，立刻通過頸動脈采取各組每只大鼠血液樣本1mL，4℃離心機中離心后取上清液，按照試劑盒方法檢測各組樣本中NO的含量。

1.8 統計學分析 采用SPSS 18.0統計學軟件進行數據處理，計量資料進行正態性及方差齊性檢驗，多組均數比較采用F分析，兩兩比較采用Dunnett-t檢驗；P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 心功能情況 與假手術組和依布硒啉組相比，心肌缺血再灌注組LVEDP升高，LVESP、SW、ESPVR和EDPVR均降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠心臟功能參數比較

LVESP：左室收縮末期壓力，LVEDP：左室舒張末期壓力，DP：上升的壓力，SW：每搏功；ESPVR：收縮末期壓力-容積關系，EDPVR：舒張末期壓力-容積關系；

注：*與假手術組比較，P<0.05；#與缺血再灌注組比較，P<0.05。下同。

2.2 心肌細胞凋亡情況 通過TUNEL染色，正常大鼠心肌細胞的TUNEL染色呈藍色，而壞死或凋亡的陽性心肌細胞細胞核染色呈棕色，見圖1。利用圖像分析軟件對圖1等各組圖像進行分析并計算AI，結果顯示：缺血再灌注組的心肌細胞凋亡指數為29.8%±6.8%，依布硒啉組的凋亡指數為19.8%±1.9%，兩者相比差異有統計學意義(P<0.05)。

圖1 TUNEL法檢測各組心肌細胞凋亡圖(400×)

2.3 各組心肌TNF-α、Caspase-3蛋白表達的情況 通過Quantity one檢測軟件對蛋白條帶進行分析，根據圖2條帶，缺血再灌注組與假手術組相比，心肌組織caspase3和TNF-α的表達分別升高了4.6倍和4.9倍；依布硒啉組比缺血再灌注組則減少了caspase-3 和 TNF-α的表達，差異均有統計學意義(P<0.05)。

圖2 western bolt檢測各組心肌Caspase-3、TNFα的表達情況

2.4 Akt/eNOS信號通路磷酸化及NO表達的情況 與假手術組相比，缺血再灌注組大鼠心肌細胞AKT和eNOS的磷酸化水平及NO的水平均出現了下降，差異有統計學意義 (P<0.01)；而依布硒啉組大鼠心肌組織Akt和eNOS的磷酸化水平、NO水平均回升，依布硒啉與假手術組相比，血NO的含量也顯著上升，差異均有統計學意義(P<0.01)，而p-Akt與p-eNOS的相對表達量比較則均無統計學意義(P>0.05)。

圖3 western bolt檢測各組心肌細胞Akt/eNOS通路磷酸化的情況

3 討論

心肌I/R是目前臨床上常見的并發癥，不僅造成心肌細胞凋亡，破壞心肌組織正常結構，更會造成心功能的下降或者致死性的心律失常[5]。在I/R過程中心肌細胞的凋亡存在著兩個主要的信號通路，一個是通過線粒體激活Caspase-3誘導細胞凋亡的內在途徑，另一個是通過Fas配體或TNF-α的外在路徑[6]。因此，如何通過藥物靶向地阻斷凋亡路徑也為我們的科學研究提供了新思路。在我們的實驗中，缺血再灌注組的TNF-α、Caspase-3表達顯著增強，驗證了心肌缺血再灌注損傷與凋亡路徑的激活密不可分，依布硒啉在I/R過程中抑制了心肌凋亡相關途徑中TNF-α 和 caspase-3蛋白的表達，這說明依布硒啉具有抑制凋亡路徑的作用。

依布硒啉是一種脂溶性化合物，因此很容易透過細胞膜進入細胞，從而發揮顯著的抗氧化作用。研究發現依布硒啉在多種器官的缺血再灌注過程中都發揮了保護作用。Chen Y等[7]研究發現依布硒啉通過減少氧化應激來減輕I/R損傷；Steinbrenner H等[8]報道在一例心臟外科手術中，依布硒啉抑制自由基的形成發揮抑制心肌細胞凋亡的作用；Lindenblatt N等[9]動物實驗研究顯示依布硒抑制血細胞聚集體的形成及保護血管內皮功能障礙從而發揮保護心肌I/R的作用。我們的研究發現依布硒啉可以減輕大鼠心肌細胞的缺血再灌注時心功能的損害；同時依布硒啉減輕了大鼠心肌細胞的再灌注凋亡。

Akt通路在心肌I/R中得作用一直是研究的熱點，Yuan Q等[10]研究發現：通過PI3K/Akt抑制劑來抑制AKT的信號后心肌缺血再灌注的保護作用缺失了。AKT的磷酸化促進了許多靶蛋白的激活，其中包括eNOS。Fang R等[11]的研究表明：體內或體外應激時AKT磷酸化也介導了eNOS的快速應答。激活的eNOS在I/R過程中發揮了重要的保護作用[12]。我們的實驗則以Akt/eNOS通路為出發點展開驗證依布硒啉發揮I/R損傷的保護作用，結果表明：在I/R過程中依布硒啉導致了Akt的磷酸化也促進了其下游蛋白eNOS的磷酸化，eNOS表達的同時也促進了血液中血管內皮舒張因子NO濃度的提高，NO能調節血管內皮細胞的生長和凋亡以及遷移，是血管生成的必須因子[13]，因而可以起到保護心肌細胞的作用。

綜上所述，依布硒啉可以通過激活Akt/eNOS通路從而發揮保護心肌I/R作用，有關于依布硒啉通過各種信號通路相互作用從而發揮保護心肌I/R作用的機制有待進一步探索。

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