山東茶園土壤高活性解鉀細菌的篩選鑒定及肥效研究

韓曉陽，周波，董玉惠，張麗霞*，侯劍，向勤锃，黃曉琴*

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山東茶園土壤高活性解鉀細菌的篩選鑒定及肥效研究

韓曉陽1,2，周波3，董玉惠1,2，張麗霞1,2*，侯劍4，向勤锃1,2，黃曉琴1,2*

l. 山東農業大學園藝科學與工程學院，山東 泰安 271000；2. 作物生物學國家重點實驗室，山東 泰安 271000；3. 泰安市農業局，山東 泰安 271000；4. 日照市嵐山區茶業管理辦公室，山東 日照 276800

為了篩選到適合山東茶園土壤環境的解鉀菌株，以提高土壤鉀素的高效轉化效率，本研究經過菌株富集、分離、純化等步驟，從山東茶園土壤中分離出9株解鉀細菌。通過有效鉀含量比較和菌株分類，篩選出1株活性最強菌株K2，經鑒定K2菌株為枯草芽孢桿菌（）。發酵試驗表明，菌株K2最適宜生長的條件為pH值6.0，溫度35℃，以麥芽糖、淀粉、玉米粉為碳源，酵母膏為氮源。施用該菌劑后土壤速效鉀和速效磷含量比對照最大分別提高28.40%和28.49%。茶葉產量最大提高36.30%，同時茶葉中氨基酸含量顯著增加，酚氨比值降低，有利于茶葉品質的提升。菌株K2可能是一株茶園土壤高效解鉀細菌，可作為后續進一步研究茶園專用微生物菌劑的參考。

山東茶園；解鉀細菌；枯草芽孢桿菌；肥效

茶葉是我國重要的經濟作物，具有獨特的營養與保健功能。目前山東茶園面積已有約2.7萬hm2（40多萬畝），其土壤多由片麻巖和花崗巖發育形成（兩類巖石中鉀長石KAlSi3O8比例較大），雖然成土母質中鉀素總量較豐富，但速效鉀含量不足[1]。為了補足茶樹對鉀的需求，茶農多施用含鉀化肥。化肥的大量使用，會導致土壤微生物多樣性降低，板結程度上升，污染了環境[2]。因此，如何在降低化肥施用量的同時，加快土壤中含鉀礦物的轉化以提高土壤有效鉀素含量，成為當前山東茶樹營養管理的研究焦點之一。

土壤中存在大量微生物，可與礦物質作用改變土壤養分結構[3]。解鉀細菌是一類能分解硅酸鹽和鋁硅酸鹽礦物，釋放鉀、磷和硅等元素的細菌[4]。前人已發現的解鉀細菌主要包括芽胞桿菌、固氮菌、假單胞菌、伯克霍爾德菌和農桿菌等[5-7]，這些菌株應用后不僅增加了土壤中鉀素的含量[8]，同時促進了產量的提高[9]，因此越來越受到人們的關注。在山東茶園土壤中如果能篩選到高活性的解鉀菌株，制備成菌劑施用于土壤中將會加速礦物中鉀的釋放，這對于提高土壤速效鉀含量具有重要的作用。本研究從山東茶園土壤中分離篩選出具有解鉀功能的高效菌株，并對其進行肥效研究，可為山東茶樹解鉀菌劑的研發提供菌種支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

菌種分離來源：山東省濟南市圣虎山茶園土壤。參比菌株為膠質芽孢桿菌（AMCC100075），該菌株由山東農業微生物菌種保藏管理中心提供。

1.2 培養基的制備

LB液體培養基：蛋白胨10?g，酵母膏5?g，NaCl 10?g，定容至1?000?mL；富集培養基：酵母膏0.5?g，蔗糖10?g，(NH4)2SO41.0?g，Na2HPO42.0?g，MgSO4·7H2O 0.5?g，CaCO31.0?g，鉀長石粉（K2O·Al2O3·6SiO2）1.0?g，定容至1?000?mL；每升富集培養基中加入15?g瓊脂為選擇培養基。培養基pH均調至7.0，使用前均在121℃條件下滅菌20?min[10]。

1.3 菌株的分離、純化

稱取10?g新鮮土壤樣品，采用梯度稀釋法及平板劃線法[10]進行菌株分離純化。所純化的菌株在選擇培養基中能產生溶鉀圈的即為解鉀細菌。

1.4 菌株分類

將菌株接種到LB液體培養基中，置于震蕩培養箱中震蕩培養，溫度為28℃，轉速200?r·min-1。培養12~24h后，5?000?r·min-1離心棄上清液，收集菌體，采用SDS-PAGE法進行菌株分類[11-13]。

1.5 菌株的鑒定

1.5.1 菌株分子鑒定

提取菌株總DNA，采用細菌16?S rDNA通用引物[11]（16S-8F：AGAGTTTGATYMTGG CTCAG；16?S-1510-R：AGGGYTACCTTG TTACGACTT），按文獻[14]的反應體系及條件進行PCR擴增檢驗。測序后將所測序列進行Blast比對分析，構建系統發育樹分析菌株系統發育地位。

1.5.2 形態特征及生理生化鑒定

菌落形態特征用肉眼進行觀察。菌株個體形態采用JEM-1200EX透射式電子顯微鏡進行觀察[15]。根據細菌鑒定手冊[16-17]進行菌株生理生化鑒定。

1.6 菌株解鉀能力及發酵液pH測定

將菌株接種到LB液體培養中，置于搖床中28℃，120?r·min-1震蕩培養，制備液體種子，以不接種為對照。當菌液OD600=0.05時，吸取種子液接種到選擇培養基中，接種量為4%，28℃，120?r·min-1培養7?d。將發酵培養液置于離心管中，5?000?r·min-1離心10?min取上清液。利用PHS-3C型pH計測定上清液pH值，采用火焰光度法[18]測定上清液中鉀含量。

1.7 菌株特性研究

1.7.1 適宜菌株生長的pH值和溫度

液體種子制備及接種量同上述1.6節內容。pH試驗設5個處理：pH=4、5、6、7、8，將接種后的培養基置于搖床中培養24?h，溫度設定為28℃，轉速設定為180?r·min-1；溫度試驗設6個處理：15、20、25、30、35、40℃，培養基pH調配至7.0，轉速同上。以上試驗震蕩培養后測定菌液OD600值。

1.7.2 單一碳源和氮源測定

碳源試驗：分別用葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、玉米粉作為初始發酵培養基中的唯一碳源；氮源試驗：分別用蛋白胨、酵母膏、尿素、豆餅粉、硫酸銨作為初始發酵培養基中的唯一氮源。28℃，120?r·min-1培養48?h后，采用微生物平板計數法[10]測定發酵液活菌數，以確定最適碳源和氮源。

1.8 菌劑效果試驗

試驗地點設在山東省濟南市圣虎山的茶園，該茶園土壤基本理化性狀為有機質含量16.1?g·kg-1，pH 5.4，硝態氮5.74?mg·kg-1，銨態氮14.82?mg·kg-1，有效磷142.82?mg·kg-1，速效鉀222.6?mg·kg-1。供試茶樹品種為福鼎大白。供試肥料為有機肥（有機質含量≥40%）及自制解鉀菌劑（有效活菌數每克10.0億個；載體為麥麩、草炭、硅藻土復合而成）。

試驗設3個處理，分別為有機肥（CK）、空白載體+有機肥（T1）、解鉀菌劑+有機肥（T2）。每個處理設2個小區，每個小區面積為60?m2，于5月下旬和8月上旬進行施肥。每個小區每次有機肥施用量為36?kg，T1、T2處理載體和菌劑的施用量為0.55?kg。分別在7月底和9月底各取1次茶樣和土樣，測定茶葉產量及生化成分，土樣過篩風干保存測定養分含量。

1.9 土壤養分測定

采用“之字形”取樣方式用取樣器取土，深度0~30?cm，將多點土樣混勻、風干過篩保存。以2?mol·L-1氯化鉀溶液為浸提劑，土液比為1︰5（質量比），置于往復振蕩機中(25±1)℃震蕩1?h，以浸提土壤中的銨態氮、硝態氮。浸提后采用靛酚藍比色法測定銨態氮，雙波長比色法測定硝態氮。

以pH 2.5的0.2?mol·L-1HOAc-0.25?mol·L-1NH4NO3為浸提劑，土液比為1︰10（質量比），置于往復振蕩機中(25±1)℃震蕩5?min，以浸提土壤中的速效磷和速效鉀。浸提后采用鉬銻抗比色法測定速效磷，采用火焰光度法測定速效鉀[3-4]。

1.10 茶樹百芽重及茶葉生化成分測定

試驗采摘1芽2葉初展的茶樹鮮葉計算百芽重。參考國家標準方法（GB/T 8303）進行固樣、磨碎、保存，進行茶葉品質生化成分分析。水分測定參考GB/T 8304—2013、水浸出物測定參考GB/T 8305—2013、茶多酚測定參考GB/T 8313—2008、氨基酸含量測定參考GB/T 8314—2013、咖啡堿測定參考GB/T 8312—2013。

1.11 數據處理

試驗所得數據采用SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析，Duncan新復極差法對處理間進行多重比較（< 0.05）。相關數據的作圖利用Excel 2010進行處理。將SDS-PAGE數據進行轉換（有條帶標記為1，無條帶標記為0），采用NTSYS 2.1軟件進行upgma聚類分析。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離純化及初篩

試驗共分離純化出菌株11株。通過利用解鉀選擇培養基對分離得到的菌株進行定性初選。結果表明，能產生明顯溶鉀圈的解鉀菌株有9株，分別為K2、K3、K13、K15、K18、K23、K28、K52、K56。菌株溶鉀情況見圖1。

2.2 菌株的復篩

2.2.1 菌株分類

試驗采用蛋白質電泳技術對9株初選菌株進行了聚類。如圖2所示，9株菌株共分成5類。菌株K2、K3屬于同一類群（類群Ⅰ），菌株K23、K52屬于同一類群（類群Ⅱ），類群Ⅲ僅有K28單一菌株，菌株K18、K56屬于同一類群（類群Ⅳ），菌株K13、K15屬于同一類群（類群Ⅴ）。

2.2.2 解鉀菌解鉀能力測定

由表1可知，菌株K2解鉀能力最高，其解鉀能力是對照菌株的3.16倍。此外，發酵完后培養液pH均出現了不同程度的下降，且與有效鉀濃度呈一定的負相關性，即有效鉀濃度越大，發酵液pH越小。綜合圖2和表1的結果，菌株K2活性最高。

2.3 菌株的鑒定

2.3.1 16?S rDNA分子鑒定

試驗提取菌株總DNA后進行了PCR擴增檢驗。如圖3所示，解鉀細菌K2的PCR條帶約在1?500?bp處，這與菌株16?S rDNA的理論值相符。

圖1 菌株溶鉀圈

圖2 解鉀細菌聚類分析樹形圖

表1 解鉀菌株解鉀能力

注：同列不同小寫字母表示差異達5%顯著水平。Note: Different letters in the same row mean significant at 5% level.

測序后將所得序列進行BLAST比對，結果表明K2與枯草芽孢桿菌（）相似率最高。選取同源性在96%以上的菌株構建系統發育樹（圖4），可見菌株K2與親緣關系最近。同時菌株K2在GenBank中進行登錄，登錄號為KX064394。

2.3.2 菌落、菌體形態及生理生化鑒定

通過對菌落形態觀察，發現K2菌株菌落為乳白色橢圓形，其表面褶皺，邊緣不整齊，不透明，菌落呈凸起狀。從個體形態來看，菌株K2為桿狀細菌，無莢膜（圖5）。

圖3 解鉀細菌16 S rDNA 電泳圖

圖4 解鉀細菌系統發育樹

注：菌株個體形態的放大倍數為10 000 倍。

表2 解鉀菌生理生化特征鑒定結果

注：“+”代表陽性，“?”代表陰性。

Note: “+”means positive, “?” means negative.

從表2可知，菌株K2革蘭氏染色、接觸酶、V-P均呈陽性，生長過程中具有需氧特點，可利用葡萄糖、蔗糖和半乳糖，能水解酪素，液化明膠。根據菌株形態特點、生理生化指標的鑒定、分子測序結果，可以認定K2為枯草芽孢桿菌（）。

2.4 菌株發酵條件

2.4.1 pH值及溫度對菌株的影響

如圖6所示，在pH值4~6時菌株活性隨著pH的增大而增大，在6時達到最大，隨后呈現下降的趨勢。可見，K2菌株最適宜生長的pH值為6，喜歡偏弱酸的生長環境。菌株在溫度為15~40℃內均能生長。隨著溫度的升高，K2菌株的活性呈現增大的趨勢，在35℃時達到最大，隨后急劇下降。可見，K2菌株最適宜生長溫度為35℃。

2.4.2 單一碳源、氮源對菌株的影響

如表3所示，菌株對單一碳源、氮源的利用情況不同。菌株K2在以玉米粉為唯一碳源的培養基中發酵生長最快，而在以葡萄糖或蔗糖為單一碳源的培養基中生長緩慢；在以酵母膏為唯一氮源的發酵培養基中生長最快。

2.5 解鉀菌劑肥效

2.5.1 解鉀菌劑對茶園土壤化學成分的影響

由表4可知，在氮素含量方面，第一次施用后T2處理硝態氮和銨態氮含量均顯著低于T1和CK，第二次施用后T2處理中兩種形態的氮表現出較高的含量，其中硝態氮含量顯著大于其它處理，而銨態氮與T1和CK沒有差別。在速效磷方面，兩次施肥T2處理都表現出較高的含量。第一次施肥后T2處理速效磷含量比CK增加了28.49%，第二次增加了24.96%，表明該菌劑在增加土壤速效磷方面起到了促進作用。此外，兩次試驗施用菌劑后土壤速效鉀含量顯著高于其它處理。第一次施肥后T2處理比CK增加了26.26%，第二次增加了28.40%，說明該菌劑能有效的促進土壤鉀的釋放。綜合兩次施肥結果可知，施用該菌劑能較好地提高茶園土壤肥力，特別是在提高磷鉀含量方面作用顯著。

圖6 不同pH 和溫度中菌株的活性

表3 單一碳源、氮源活菌數

注：不同小寫字母表示差異達5%顯著水平。

Note: Different letters mean significant at 5% level. mg·kg-1

表4 不同施肥處理對土壤養分的影響

注：同行中不同小寫字母表示差異達5%顯著水平。

Note: Different letters mean significant at 5% level within the same line.

表5 不同施肥處理對茶樹百芽重的影響

2.5.2 解鉀菌劑對茶樹百芽重的影響

從表5可以看出，第一次施肥后T2菌劑處理顯著大于其它處理，增產率達到36.3%。從第二次施肥結果來看，百芽重均出現了一定程度的下降，但T2處理仍顯著高于其它處理。綜合分析來看，T2處理茶樹百芽重增重顯著，兩次施肥效果相當，而T1處理與CK處理沒有明顯差異。可見，施用自制解鉀菌劑能顯著提高茶樹百芽重，且效果穩定。

2.5.3 解鉀菌劑對茶葉生化成分的影響

從表6可以看出，第一次施肥后，水浸出物含量以T2最高，水浸出物越多茶湯內含物越豐富。通過施用菌劑降低了茶葉中咖啡堿的含量，T2比單施有機肥降低8.99%。茶多酚含量不同處理間未表現出差別，而氨基酸則以T2最高。茶葉酚氨比值出現了差異，以T2最小。第二次施肥后，T2處理水浸出物含量略大于T1和CK，但沒有差異。咖啡堿與氨基酸含量與第一次施肥相似，而茶多酚含量下降明顯。兩次施用空載體的處理與單施有機肥的處理均沒有明顯差異。綜合兩次施肥結果可知，解鉀菌劑能顯著增加鮮葉中氨基酸含量，降低酚氨比，使茶葉滋味更加鮮爽，有利于茶葉品質的提高。

3 討論

山東土壤中富含鉀硅酸鹽礦物，該礦物只有在理化因素和微生物的作用下，通過分解逐步釋放出鉀，供植物生長利用。因此，篩選可高效降解鉀的微生物對于提高土壤有效鉀含量至關重要[19]。解鉀菌作為一種有益功能菌，可將束縛態鉀轉化成有效鉀供植物吸收利用[20]。本研究從茶園土壤中篩選出了高活性解鉀菌株K2。經鑒定K2為枯草芽孢桿菌（）。前人從水稻植株根際、菜園等處分離獲得多株高效解鉀菌株，亦多為假單胞菌屬和芽孢桿菌屬等屬菌株[21-23]，且孫海新[24]也發現茶園土壤中解鉀細菌多為芽孢桿菌屬，這與本試驗結果一致。

不同解鉀微生物的解鉀能力存在較大差異。前人對微生物解鉀機理研究發現，微生物可以通過酸溶、酶解、莢膜吸收等[25-27]方式進行解鉀。本試驗在對解鉀細菌生長特性研究時發現，該菌株喜歡在偏酸性的環境中繁殖，同時隨著解鉀量的增大，發酵液的pH值降低幅度越大，這與燕紅等[28]試驗結果相似。這種現象的出現可能是該菌在繁殖過程中有酸性物質分泌[29-30]，從而導致環境中pH值下降。對于引起pH值下降的原因以及菌株解鉀機制將在后續的試驗中進一步研究。

表6 不同施肥處理對茶葉品質的影響

注：同行中不同小寫字母表示差異達5%顯著水平。

Note: Different letters mean significant at 5% level within the same line.

此外，一些微生物除了具有解鉀的功能外，還具有解磷、固氮等其它功能。燕紅等[28]在發酵解鉀菌株過程中出現了顯著的溶磷特點，可溶性磷增加量達6.81?μg·mL-1。韓麗珍等[31]人從茶樹根際土壤中篩選出GD-3和GD-12解鉀菌，菌株除了具有解鉀能力外，還具有解磷、產NH3、產HCN能力，可分泌嗜鐵素及具有ACC脫氨酶活性。本試驗在接種后也發現，土壤中不僅速效鉀的含量有較大的提升，速效磷的含量也顯著提高，可能該菌產生了同時具有溶鉀和溶磷的酸性成分[28]，從而促進了鉀、磷含量的提高。

目前研究表明野生菌株在擴繁的過程中容易導致某些功能喪失和活力下降，降低微生物的功效。因此，本項目下一步將在菌株K2的基礎上，采用紫外誘變技術對其進行改良，以提高菌株的活性和解鉀能力，從而保證菌株功效的穩定性。

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Screening, Identification and Fertilizer Efficiency of Potassium Bacterium from the Soils of Tea Garden in Shandong

HAN Xiaoyang1,2, ZHOU Bo3, DONG Yuhui1,2, ZHANG Lixia1,2*,HOU Jian4, XIANG Qinzeng1,2, HUANG Xiaoqin1,2*

1. College of Horticulture Science and Engineering, Shandong Agriculture University, Tai'an 271018, China; 2. State key Laboratory of Crop Biology, Tai'an 271018, China; 3. Tai'an Agricultural Bureau, Tai'an 271018, China; 4. Tea Industry Administration Office of Lanshan, Rizhao 276800, China

The potassium bacterium suitable for soil environment in Shandong tea garden was screened to improve the transformation efficiency of soil potassium.By the experimental procedure of enrichment culture and microbial purification, 9 potassium bacterium strains were obtained from the soil of tea garden in Shandong Province. According to the activity comparison and taxonomy of strains, a strain with the highest activity was selected. The strain K2 was identified as. Meanwhile, the effects of growth environment of the strains were measured. The results showed that the optimum pH and temperature for K2 were 6.0 and 35℃. It was suitable for K2 to ferment with maltose, starch and corn flour as the carbon source, and with yeast extract as the nitrogen source. After applying the bacteria agent, the contents of available potassium and phosphorus in tea garden soil increased by 28.40% and 28.49% respectively. Meanwhile the tea yield increased by 36.30%. The amino acid contents in tea were also significantly increased, and the polyphenols/amino acids decreased, which benefit tea quality.The K2 may be a high efficient potassium bacterium in tea garden soil, which can be used as a reference for further research on special microbial inoculum in tea garden.

tea garden in Shandong, potassium bacterium,, fertilizer efficiency

S571.1；S154.3

A

1000-369X(2018)01-078-09

2017-06-05

2017-08-01

山東省“雙一流”獎補資金，泰安市科技發展專項（201340629）、泰安市農業產業化扶持項目（02032909）、泰安市科技發展計劃項目（201640576）

韓曉陽，男，講師，主要從事茶樹生理與生態方面的研究。*通訊作者zlx_sdau@163.com，31532504@qq.com