基于SSR標記的白化和黃化茶樹品種遺傳多樣性分析及指紋圖譜構建

王松琳，馬春雷，黃丹娟，馬建強，金基強，姚明哲*，陳亮*

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基于SSR標記的白化和黃化茶樹品種遺傳多樣性分析及指紋圖譜構建

王松琳1,2，馬春雷1,2，黃丹娟1，馬建強1，金基強1，姚明哲1*，陳亮1*

1. 中國農業科學院茶葉研究所國家茶樹改良中心/農業部茶樹生物學與資源利用重點實驗室，浙江 杭州 310008；2. 中國農業科學院研究生院，北京 100081

利用62對SSR引物對16個白化、黃化茶樹品種資源的遺傳多樣性進行了分析，初步明確了不同白化、黃化品種的遺傳結構，以及SSR標記在白化、黃化品種鑒定上的適用性，為此類茶樹品種資源的鑒定評價提供了理論依據。經過對引物篩選和擴增條帶的分析，結果顯示：具有多態性的55對引物中，共檢測出169個等位基因，每對引物檢測出的等位基因數為2~5個，平均為3.07個；多態信息含量（PIC）和Shannon信息指數（I）的平均值分別是0.40和0.79；169個等位基因出現頻率在3.12%~96.88%之間；16個參試品種的遺傳距離在0.086~0.532，品種間遺傳結構差異明顯；當D≈0.18時，可將16個品種劃分為3類，其中大部分親緣關系相近或地理位置一致的品種聚為一類。此外，筆者根據不同引物的等位基因帶型構建了16個白化和黃化茶樹品種的分子指紋圖譜，并篩選出3對核心引物（TM156、TM508、MSG0380）用于不同白化、黃化茶樹品種的鑒定。

白化；黃化茶樹；SSR標記；指紋圖譜

白化、黃化茶樹是一類在特定條件下產生的具有不同程度葉綠素缺失的葉色突變體，屬于茶樹中的珍稀資源，目前在全國各地均有發現，如浙江的安吉白茶、景寧白茶、黃金芽，福建的白雞冠、金冠茶，江西的黃金菊等。已有研究表明，這類茶樹資源由于代謝機制的特異性，新梢芽葉的葉綠素合成減少，碳代謝受抑制，使其芽葉呈現出不同程度的白化或黃化現象，同時由于氮代謝增強，顯著提高了游離氨基酸的生成量，使得有些品種資源的游離氨基酸含量能達到6%以上，茶氨酸含量達3%以上[1-4]，以這類葉色突變體為原料制作的茶樣，因具有更高的氨基酸含量和更優異的外形，使其經濟價值更高，已成為各地茶農增收的重要途徑[5-6]。但隨著新育成白化、黃化茶樹品種的增多，以及新品種較高的苗木及成品茶價格，很多不法商販開始利用茶葉和茶苗品種不易鑒定的特點，隨意對已有品種進行更名銷售，導致市面上的此類茶樹品種魚龍混雜，“同物異名”和“同名異物”現象時有發生，嚴重損害了茶農和消費者的權益。因此，迫切需要建立一套快速、準確的技術體系用于不同白化、黃化茶樹品種資源的鑒別，從而保證我國“白化和黃化茶”產業的健康發展。

基于形態特征的品種鑒定方法易受環境條件的影響，且要求鑒定者具有豐富的品種形態學鑒定經驗，同時在實際應用中，往往因受到物候期的影響而無法及時準確地鑒定大量品種。隨著分子生物學技術的不斷發展，從DNA水平上對品種的遺傳特異性進行快速、準確、不受環境影響的鑒定已成為可能。作為當今最先進的指紋鑒定技術，分子指紋圖譜已發展出多種如RAPD（Random amplified polymorphic DNA）、AFLP（Amplified fragment length polymorphism）、SSR（Simple sequence repeat）和SNP（Single nucleotide polymorphism）等標記技術。其中SSR標記以其多態性好、擴增位點數量多、共顯性遺傳及操作簡單等特點，在構建DNA指紋圖譜中應用最為廣泛[7-9]。2007年SSR標記和SNP標記一起被國際植物新品種保護組織（Union for the Protection of New Varieties of Plants，UPOV）推薦為構建DNA指紋數據庫的標記方法。目前這一方法已廣泛應用于小麥[10-11]、玉米[12-13]、水稻[14-15]等多種農作物的品種鑒定，同時在楊樹、櫻桃、銀杏等木本植物[16-18]中也有大量應用。李莉等[19]利用36對SSR引物建立了大穗稻1126的DNA指紋數據庫，可以有效解決雜交水稻親本1126的真偽性及與其他品種的區分問題；王立新等[20]利用SSR標記建立了蘋果栽培品種的DNA指紋圖譜庫，并進行了品種鑒定。同時SSR分子標記在茶樹遺傳多樣性和構建指紋圖譜上的研究亦有大量的報道，如喬小燕等[21]利用105對核心EST-SSR標記分析了廣西、廣東的105份茶樹資源，剖析遺傳結構并據此繪制了遺傳結構圖；黃丹娟等[22]從30對SSR引物中篩選出4對核心引物，構建了39個PVP申請茶樹品種及近似品種的指紋圖譜，并為每個參試品種建立了24位數的圖譜二維碼。

本研究利用62對SSR引物對16種不同白化、黃化茶樹品種資源進行分子鑒定，通過選取最少的核心引物組合，構建SSR分子指紋圖譜；同時通過聚類分析初步揭示不同參試茶樹品種之間的遺傳結構，以期為今后鑒定區別此類茶樹品種提供支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

供試的16種白化、黃化茶樹品種，均采自國家種質杭州茶樹圃（表1）。采摘各供試樣品完整、無病蟲害感染的一芽二葉新梢，液氮迅速冷凍后，于－80℃環境中保存備用。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取方法

將所有樣品在液氮中磨成粉末，采用改良的CTAB法[23]提取基因組DNA，利用ND-1000微量紫外分光光度計測定DNA濃度和純度，1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質量，后將DNA濃度稀釋至工作濃度20?ng·μL-1，用于PCR擴增，剩余原液于－20℃保存備用。

1.2.2 PCR擴增及產物檢測

從本實驗室設計、篩選的SSR引物中選取62對多態性高、擴增條帶清晰、重復性好的引物，用于供試材料的SSR-PCR分析。PCR反應在ABI公司的PCR擴增儀上進行，采用10?μL的PCR反應體系：ddH2O 6.2?μL、DNA 2?μL、Tap酶（2?U·μL-1）0.2?μL、dNTP（10?nmol·L-1）0.2?μL、10×PCR Buffer（Mg2+）1?μL，以及上下游Primer（10?μmol·L-1）各0.2?μL，PCR擴增程序為94℃預變性4?min；94℃變性30?s，不同溫度下退火30?s，72℃延伸30?s，共35個循環，循環結束后72℃延伸7?min，4℃保存。擴增產物用10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，150?V電壓下電泳80?min，銀染法顯色[24]，之后用凝膠成像儀拍照并記錄。

表1 供試茶樹品種的名稱及產地

1.2.3 數據處理及分析

數據處理采用人工讀帶的方法，將電泳圖上目的片段范圍內清晰的條帶，按照分子量大小，從大到小按照A、B、C、D、E等依次記錄，缺失條帶以“XX”表示，記錄每個參試品種的基因型。利用軟件POPGENE[25]分析62對引物在16個參試品種中的擴增等位基因數（Observed number of alleles, Na）、有效等位基因（Effective number of alleles, Ne）、觀測雜合度（Observed heterozygosity, HO）、期望雜合度（Expected heterozygosity, HE）、Shannon信息指數（Shannon′s information index, I）及等位基因出現頻率（Allele frequency）；利用軟件PowerMarker[26]計算基因型數（Genotype）和多態性信息量（Polymorphism information content, PIC），之后計算16個品種間的Nei′s遺傳距離[27]，并構建Neighbor-Joining（NJ）系統進化樹，進行聚類分析。最后從中挑選多態性含量高、擴增條帶清晰的引物作為核心引物，根據其基因型轉化為0和1代碼，用于構建16個參試品種的DNA指紋圖譜。

2 結果與分析

2.1 16個白化和黃化茶樹品種的SSR多態性

觀測62對引物的譜帶，發現除7對引物（TM347、TM368、TM414、TM568、TM577、TM585、TM614）之外，剩余的55對引物擴增出的譜帶均表現出多態性。分析這55對引物的擴增結果（表2），發現共擴增出169個等位基因（Na），平均每對引物擴增出3.07個，最多有5個，最少的只有2個；有效等位基因（Ne）的變異范圍在1.06~3.61之間，平均值為2.06；共檢測到基因型234個，范圍在2~9個之間；引物的觀測雜合度（HO）最大值為0.87（TM154），最小值為0（TM209）；期望雜合度（HE）最大值為0.75（TM508），最小值為0.12（TM512、TM590、TM598、TM609）；Shannon信息指數（I）的范圍在0.14~1.39之間，平均值為0.79；而多態性信息含量（PIC）變化范圍較大，在0.06~0.68之間，平均值為0.40，其中引物TM508的PIC值最高，而大于等于平均值的引物有31個，超過具有多態性引物總數的一半，這說明這些引物總體上多態性情況尚好，而多態性的高低往往與引物鑒別力有關，多態性越高，則鑒別力就越強[28]。

2.2 SSR標記的各等位基因出現頻率

55對具多態性的引物共擴增得到169個等位基因，其中TM584等位基因B的出現頻率最高，達到96.88%；而等位基因出現頻率最低為3.12%，分別為TM237的等位基因C、TM377的等位基因C、TM384的等位基因A等15個等位基因上（圖1）。由此可以看出16個參試茶樹品種各等位基因出現頻率差異很大。

表2 16個參試茶樹品種SSR標記的擴增結果

續表2

標記等位基因有效等位基因基因型數觀測雜合度期望雜合度Shannon信息指數多態性信息含量 MarkerNaNeGenotypeHOHEIPIC TM467TM471TM476TM489TM494TM497TM505TM508TM512TM524TM526TM535TM536TM542TM561TM562TM566TM576TM584TM590TM596TM597TM598TM602TM609TM613TM620TM623MSG0380MSE0103MSE0107MSE0108MSE04503222333535322422432234232322533231.911.361.751.201.292.832.173.611.142.232.171.971.282.681.931.282.251.381.061.132.932.471.131.291.131.951.992.003.201.681.951.281.384332454936432633432265232433744340.130.190.250.190.130.250.630.750.130.530.560.500.250.500.560.130.130.310.060.130.680.540.130.250.130.440.670.470.750.440.600.130.250.490.270.440.180.230.670.560.750.120.570.540.510.230.650.500.230.570.280.060.120.660.620.120.230.120.500.510.520.710.420.500.230.280.830.430.620.310.451.070.861.390.281.080.860.690.381.140.680.381.040.530.140.231.091.040.230.450.230.810.690.691.280.730.770.380.540.430.230.340.160.210.570.450.680.120.510.450.370.200.570.370.200.510.260.060.110.580.520.110.210.110.410.370.380.630.370.400.200.26 Mean3.072.064.250.420.470.790.40

2.3 16個白化和黃化茶樹品種親緣關系分析

根據選取的55對SSR標記的等位基因出現頻率，計算其Nei′s遺傳距離（D），結果發現16個茶樹品種的遺傳距離在0.086~0.532之間，其中黃金芽與黃葉寶之間的遺傳距離最大，四明雪芽和千年雪的遺傳距離則最小（表3）。

基于Nei′s遺傳距離，采用NJ法繪制16個品種的聚類圖（圖2）。從聚類圖中可以看出，當D≈0.18時，16個品種基本聚為三大類，第Ⅰ類僅有2個品種，分別是來自江西的黃金菊和本課題組選育的株系花葉，它們屬于黃化茶樹資源，其黃化期較長，且春季新梢均表現出淺紫紅色；第Ⅱ類包括御金香、天臺白茶等10個品種，其中來自景寧的白茶品種景寧白茶1號和景寧白茶2號，以及來自浙江余姚的品種四明雪芽和千年雪都聚到了一起，但同樣來自余姚的御金香和黃金芽則與它們表現出較遠的遺傳距離，說明地理來源相同的品種可能會因為具有相似的遺傳背景聚集到一起，也可能因為親本來源不同而表現出較大的遺傳差異；第Ⅲ類則包括中黃2號、黃金芽、中黃1號和越鄉白茶4個品種，它們分別是從浙江縉云、余姚、天臺和嵊州當地群體種中發現的自然突變單株選育而來，聚類結果說明它們的遺傳基礎更相近。

注：A~E 表示不同等位基因。Note: A-E present different alleles.

2.4 DNA指紋圖譜的構建

分析篩選出的55對SSR引物擴增結果，參試的16個品種均具有特征譜帶（表4）。從表中可以看出，具有特征引物的16個品種中，每個品種都至少有1對引物可以獨立鑒別，最多的可達9對，利用特征引物可以對相應品種完成快速鑒定，但沒有任何一對引物能夠將這16個白化、黃化茶樹品種全部區分開，這就需要通過引物相互組合的方式，利用2對或2對以上的引物進行區分。

綜合考慮55對引物擴增條帶清晰度、基因型數目及PIC值等因素，遵循以最少的引物鑒定全部品種的原則，篩選引物通過排列組合進行區分。本研究選取TM156、TM508、MSG0380 3對引物（圖3），便可將參試的16個品種全部區分開，3對引物基因型數均≥6，PIC值≥0.54。之后3對引物按TM156、TM508、MSG0380的固定順序，將其等位基因型轉化0、1代碼串聯下來，作為16個茶樹品種的指紋圖譜，每個品種均得到1個14位數字的指紋圖譜編碼（表5）。

表3 16個參試茶樹品種之間的遺傳距離

注：JB1：景寧白茶1號，MP：MP1001，QNX：千年雪，YJX：御金香，HYB：黃葉寶，HY：花葉，AJHC：安吉黃茶，HJJ：黃金菊，AJBC：安吉白茶，TTBC：天臺白茶，SMXY：四明雪芽，JB2：景寧白茶2號，YXBC：越鄉白茶，ZH1：中黃1號，HJY：黃金芽，ZH2：中黃2號。

Note: JB2: Jingning Baich1, MP: MP1001, QNX: Qiannianxue, YJX: Yujinxiang, HYB: Huangyebao, HY: Huaye, AJHC: Anji Huangcha, HJJ: Huangjinju, AJBC: Anji Baicha, TTBC: Tiantai Baicha, SMXY: Siming Xueya, JB2: Jingning Baich2, YXBC: Yuexiang Baicha, ZH1: Zhonghuang1, HJY: Huangjinya, ZH2: Zhonghuang2.

圖2 16 個參試茶樹品種Neighbor-Joining 聚類圖

表4 16個參試茶樹品種的特征引物

圖3 3 對核心引物的擴增條帶圖

表5 16個茶樹品種的分子指紋圖譜號碼

3 討論

3.1 不同白化品種的遺傳特性分析

茶產業的發展與新品種的培育和推廣有著密不可分的關系，而茶樹種質資源是培育優質茶樹品種的基礎，在茶樹育種研究中具有非常重要的地位。我國作為茶樹的原產地，茶樹種質資源非常豐富，而其中紫化、黃化、白化等葉色變異資源因其較高含量的特征成分而備受關注。近十幾年在全國各地陸續發現了十幾種白化、黃化茶樹資源，而浙江是目前白化茶樹種質資源出現最為集中的區域，如目前推廣面積較大的白葉1號（原安吉白茶）、黃金芽及中黃系列等[29-33]。這些資源大多源自群體種中的自然突變，因對其遺傳背景不了解，導致很多資源無法作為骨干親本快速地用于白化茶樹品種的遺傳改良[34-36]。

因此，本實驗室從2013年開始，對保存在國家種質杭州茶樹圃的十幾份白化茶樹資源的遺傳特性進行了初步分析，發現目前這些資源的白化表型均不屬于細胞質遺傳，其中具有葉色遺傳特性的品種有7個，分別為黃金芽、白雞冠、安吉黃茶、中黃1號、中黃2號和安吉白茶，其中白雞冠的遺傳力最強，但因目前獲得的實生種子和成活植株數量都有限，其他還有未被發現的具有遺傳特性的黃化、白化資源也還有待進一步觀察確定。

3.2 SSR引物的篩選

目前，構建指紋圖譜往往遵循以盡可能少的引物區分全部參試品種這一原則，以求降低實驗成本，減少繁重的實驗工作，提高檢測效率[37]。引物的篩選是利用SSR標記構建指紋圖譜的重要組成部分，往往要求引物多態性PIC值高，穩定性好。

本研究最初選用62對引物對參試品種進行擴增，通過擴增譜帶進行初步篩選，每個樣品均能獲得1~2條譜帶，其中55對引物的擴增效果較為穩定，均具有多態性，且平均多態信息含量為0.4，其中有21對引物多態信息含量較高（PIC＞0.5），多態性適中（0.2＜PIC＜0.5）的引物有26個，而多態性較差（PIC＜0.2）的僅有8個。多態信息含量是選取核心引物構建指紋圖譜的參考條件，本研究所選用的55對SSR引物整體水平良好，符合構建指紋圖譜進而進行品種鑒定的要求。

3.3 不同白化和黃化茶樹品種DNA指紋圖譜的構建

目前建立DNA指紋圖譜，主要采用的方法是核心引物組合法，這一方法并不需要進行大量的引物篩選工作，只需通過核心引物組合的方式就能將多個親緣關系很近的品種區分開[38-40]，既保證鑒別的準確度，又能提高鑒別效率，在其他作物研究中已有大量應用。目前茶樹中利用核心引物組合法構建指紋圖譜已有一定研究基礎，章志芳等[41]采用EST-SSR標記對14個茶樹品種進行遺傳多樣性分析和分子指紋鑒定，并從中選取4個核心標記構建各品種的指紋圖譜；郭燕等[42]從20對SSR標記中篩選出4對核心標記，構建了40份貴州古茶樹資源的指紋圖譜，每份材料都獲得1個18位的分子指紋圖譜號碼。本研究從55對引物中篩選出了3對核心引物，構建了16個白化茶樹品種的分子指紋圖譜，利用該圖譜可對目前市場上主栽的白化茶樹品種進行鑒別，研究結果對今后白化新品種的選育和保護具有重要的意義。

[1] Xu YX, Shen CJ, Ma JQ, et al. Quantitative succinyl-proteome profiling ofcv. ‘Anji Baicha’ during periodic albinism [J]. Scientific Reports, 2017, 7(1): 1873.

[2] Li CF, Yao MZ, Ma CL, et al. Differential metabolic profiles during the albescent stages of 'Anji Baicha' () [J]. PLoS One, 2015, 10(10): e0139996.

[3] Ma CL, Chen L, Wang XC, et al. Differential expression analysis of different albescent stages of ‘Anji Baicha’ ((L.) O. Kuntze) using cDNA microarray [J]. Scientia Horticulturae, 2012, 148(4): 246-254.

[4] Feng L, Gao MJ, Hou RY, et al. Determination of quality constituents in the young leaves of albino tea cultivars [J]. Food Chemistry, 2014, 155（11）: 98-104.

[5] 盧翠, 沈程文. 茶樹白化變異研究進展[J]. 茶葉科學, 2016, 36(5): 445-451.

[6] 馬春雷, 姚明哲, 王新超, 等. 茶樹葉綠素合成相關基因克隆及在白葉1號不同白化階段的表達分析[J]. 作物學報, 2015, 41(2): 240-250.

[7] 梁明山, 曾宇, 周翔, 等. 遺傳標記及其在作物品種鑒定中的作用[J]. 植物學報, 2001, 18(3): 257-265.

[8] 馬建強, 姚明哲, 陳亮. 茶樹種質資源研究進展[J]. 茶葉科學, 2015, 35(1): 11-16.

[9] 黃丹娟, 馬建強, 陳亮. 茶樹DNA分子指紋圖譜研究進展[J]. 茶葉科學, 2015, 35(6): 513-519.

[10] 陳新民, 何中虎, 史建榮, 等. 利用SSR標記進行優質東小麥品種（系）的遺傳多樣性研究[J]. 作物學報, 2003, 29(1): 13-19.

[11] 程保山, 徐海風, 顧正中, 等. 淮安地區主栽小麥品種指紋圖譜的構建及遺傳多樣性分析[J]. 浙江農業學報, 2011, 23(1): 20-24.

[12] 譚君, 丁仲芳, 孫仕賢, 等. 西南常用玉米自交系SSR指紋圖譜構建[J]. 西南農業學報, 2003, 16(2): 1-6.

[13] 李麗華, 魏昕, 潘光堂. 20個骨干玉自交系的SSR指紋圖譜構建[J]. 西南農業學報, 2007, 20(6): 1172-1175.

[14] 肖小余, 王玉平, 張建勇, 等. 四川省主要雜交稻親本的SSR多態性分析和指紋圖譜的構建與應用[J]. 中國水稻科學, 2006, 20(1): 1-7.

[15] 陸徐忠, 從夕漢, 劉海珍, 等. 雜交水稻親本分子身份證及SSR指紋數據庫的建立[J]. 核農學報, 2012, 26(6): 853-861.

[16] 藕丹, 樊軍鋒, 周永學, 等. 美洲黑楊×青楊派雜種無性系SSR指紋圖譜的構建與遺傳差異性分析[J]. 西北林學院學報, 2017(2): 112-116.

[17] 艾呈祥, 張力思, 魏海蓉, 等. 甜櫻桃品種SSR指紋圖譜數據庫的建立[J]. 中國農學通報, 2007, 23(5): 55-58.

[18] 王星星, 周琦, 陶圓圓, 等. 48個果用銀杏品種SSR指紋圖譜構建與遺傳多樣性分析[J]. 分子植物育種, 2017, 15(5): 1963-1970.

[19] 李莉, 宋書鋒, 劉全勝, 等. 利用SSR分子標記建立雜交水稻指紋圖譜[J]. 長江大學學報（自然科學版）：農學卷, 2008, 5(4): 67-70.

[20] 王立新, 張小軍, 史星雲, 等. 蘋果栽培品種SSR指紋圖譜的構建[J]. 果樹學報, 2012(6): 971-977.

[21] 喬小燕, 喬婷婷, 周艷華, 等. 基于EST-SSR的廣東御廣西茶樹資源遺傳結構和遺傳分化比較分析[J]. 中國農業科學, 2011, 44(16): 3297-3311.

[22] 黃丹娟, 馬建強, 陳亮. 茶樹PVP申請品種的SSR分子標記鑒定和系譜關系分析[J]. 茶葉科學, 2016, 36(1): 68-76.

[23] Dellaporta S L, Wood J, Hicks J B. A plant DNA mini preparation: version II [J]. Plant Molecular Biology Reporter, 1983(1): 19-21.

[24] Charters Y M, Wilkinson M J. The use of self-pollinated progenies as ‘in-groups’ for the genetic characterization of cocoa germplasm [J]. Theoretical and Applied Genetics, 2000, 100(1): 160-166.

[25] Yeh F C, Yang R C, Boyle T B, et al. POPGENE, the user-friendly shareware for population genetic analysis [R]. Edmonton: Molecular Biology and Biotechnology Centre, University of Alberta, 1997: 112-118.

[26] Liu K, Muse S V. PowerMarker an integrated analysis environment for genetic marker analysis [J]. Bioinformatics, 2005, 21(9): 2128-2129.

[27] Takezaki H, Nei M. Genetic distances and reconstruction of phylogenetic trees from microsatellite DNA [J]. Genetics, 1996, 144(1): 389-399.

[28] 楊陽, 劉振, 趙洋, 等. 湖南省主要茶樹品種分子指紋圖譜的構建[J]. 茶葉科學, 2010, 30(5): 367-373.

[29] 張蘭, 李鑫, 魏吉鵬, 等. 白葉一號的低溫抗逆特性分析[J]. 茶葉科學, 2017, 37(1): 71-77.

[30] 王開榮, 李明, 梁月榮, 等. 茶樹新品種黃金芽選育研究[J]. 中國茶葉, 2008, 30(4): 21-23.

[31] 夏功敏, 唐茜, 張淑娟, 等. 黃金芽等五個引進特色茶樹品種春梢生化品質特性初探[J]. 西南農業學報, 2014, 27(3): 978-983.

[32] 黃茶育種協作組. 特異優質茶樹新品種“中黃1號”選育研究[J]. 中國茶葉, 2014, 36(9): 8-9.

[33] 虞富蓮. 中黃1號、中黃2號的特異性、一致性和穩定性[J]. 中國茶葉, 2016, 38(3): 14-16.

[34] 王開榮, 梁月榮, 李明, 等. 白化和紫花茶種質資源開發進展[J]. 中國茶葉加工, 2015(3): 5-8.

[35] 王開榮, 梁月榮, 張龍杰, 等. 白化茶種質資源的分類及特性[J]. 中國茶葉, 2008, 30(8): 9-11.

[36] 王開榮, 梁月榮, 李明, 等. 白化茶骨干親本及其家系種質性狀分析[J]. 茶葉, 2015, 41(3): 130-132.

[37] 劉新龍, 馬麗, 陳學寬, 等. 云南甘蔗自育品種DNA指紋身份證構建[J]. 作物學報, 2010, 36(2): 202-210.

[38] 王讓劍, 楊軍, 孔祥瑞, 等. 福建15個茶樹品種SSR遺傳差異分析與指紋圖譜建立[J]. 福建農業學報, 2014, 29(10): 970-975.

[39] Ujihara T, Ohta R, Hayashi N, et al. Identification of Japanese and Chinese green tea cultivars by using simple sequence repeat markers to encourage proper labeling [J] . Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 2009, 73(1): 15-20.

[40] 張成才, 劉園, 姜燕華, 等. SSR標記鑒定浙江省主要無性系茶樹品種的研究[J]. 植物遺傳資源學報, 2014, 15(5): 926-931.

[41] 章志芳, 馬建強. 基于SSR標記的茶樹新品種遺傳多樣性分析及指紋圖譜構建[J]. 湖南農業科學, 2012(19): 1-4.

[42] 郭燕, 劉聲傳, 曹雨, 等. 基于SSR標記貴州古茶樹資源的遺傳多樣性分析及指紋圖譜構建[J]. 西南農業學報, 2016, 29(3): 491-497.

Analysis of Genetic Diversity and Construction of DNA Fingerprints of Chlorophyll-deficient Tea Cultivars by SSR Markers

WANG Songlin1,2, MA Chunlei1,2, HUANG Danjuan1, MA Jianqiang1, JIN Jiqiang1，YAO Mingzhe1*, CHEN Liang1*

1. Tea Research Institute of the Chinese Academy of Agricultural Sciences, National Center for Tea Improvement, Key Laboratory of Tea Biology and Resource Utilization, Ministry of Agriculture, Hangzhou 310008, China; 2. Graduate School of Chinese Academy of Agriculture Science, Beijing 100081, China

To differentiate and identify different albino tea cultivars, sixty two SSR primers were used to analyze the genetic diversity of 16 tea cultivars that exhibit the chlorina phenotype. The result showed that a total of 169 alleles were amplified by 55 SSR primers with good polymorphism, and the number of alleles per primer ranged from 2 to 5, with an average of 3.07. The average value of polymorphism information content (PIC) and Shannon’s information index (I) was 0.40 and 0.79 respectively, which indicate these albino and yellow-leaf tea cultivars having a moderate level of diversity. And the occurrence frequency of 169 alleles ranged from 3.12% to 96.88%. It suggested the difference of genetic structure among tested varieties is obvious. The Nei′s genetic distance (D) of sixteen tested cultivars ranged from 0.086 to 0.532. These cultivars could be divided into three categories when D was 0.18, and the cultivars with close relatives or similar geographical origin were clustered into one group. Lastly, three primers (TM156, TM508, MSG0380) with easy identification, good stability and high polymorphism, were finally chosen to establish the fingerprint. The 16 albino and yellow-leaf tea cultivars could be effectively distinguished by the primers. This study provided an important basis for the identification of albino tea cultivars, and the evaluation and utilization of these germplasm resources.

albino tea cultivars, SSR marker, fingerprinting

S571.1；Q52

A

1000-369X(2018)01-058-11

2017-07-07

2017-08-21

中國農業科學院科技創新工程（CAAS-ASTIP-TRICAAS）、國家茶葉產業技術體系（CARS-23）、國家自然科學基金（31100504、31500568）、浙江省公益技術研究農業項目（2016C32024）、浙江省農業（茶樹）新品種選育重大科技專項子課題（2016C02053-5）

王松琳，男，碩士研究生，主要從事茶樹資源育種研究。*通訊作者