高效液相色譜-熒光法測(cè)定尿液中尿靛甙

偉麗

(北京市理化分析測(cè)試中心，有機(jī)材料檢測(cè)技術(shù)與質(zhì)量評(píng)價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100094)

隨著我國經(jīng)濟(jì)水平的飛速發(fā)展，人民的飲食結(jié)構(gòu)也發(fā)生著不斷的變化，高熱量、高蛋白、高脂肪食物的大量攝入，使得高血壓、糖尿病等慢性疾病嚴(yán)重威脅著我國居民的身體健康。當(dāng)人體攝入過量蛋白質(zhì)而不能完全消化吸收時(shí)，蛋白質(zhì)在腸道細(xì)菌的作用下分解并腐敗，產(chǎn)生多種可引發(fā)內(nèi)分泌和代謝性疾病[1]有害物質(zhì)，其中吲哚就是主要副產(chǎn)物之一[2]。近些年，越來越多的研究表明，檢測(cè)尿液中靛甙(Urine indican)的水平，可以在一定程度上反映體內(nèi)由蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為吲哚等有害物質(zhì)的數(shù)量；且可根據(jù)尿靛甙的水平存的個(gè)體化差異制定個(gè)體化飲食營養(yǎng)指導(dǎo)方案，從而有效的調(diào)節(jié)個(gè)體營養(yǎng)結(jié)構(gòu),有助于人體健康體質(zhì)的形成[3]。由于檢驗(yàn)結(jié)果是選擇合適治療方法或藥物的重要依據(jù)[4],現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)檢驗(yàn)方法的靈敏度和準(zhǔn)確度的要求也越來越高。目前對(duì)于尿靛甙含量測(cè)定的常用方法仍是采用半自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行顯色法檢測(cè),該方法前處理操作復(fù)雜,靈敏度較低。因此,建立一種用于人體中尿靛甙等有害物質(zhì)更準(zhǔn)確、靈敏度更高的檢測(cè)分析方法，對(duì)于輔助監(jiān)控體內(nèi)代謝狀態(tài)、降低體內(nèi)有害物質(zhì)水平、促進(jìn)健康體質(zhì)的形成具有重要的意義。

本研究建立了利用高效液相色譜-熒光檢測(cè)法(High performance liquid chromatography -fluorescence detection，HPLC-FD)測(cè)定尿液中尿靛甙含量的色譜分析方法，該方法適用于人體尿液樣品中尿靛甙含量的測(cè)定, 是對(duì)目前個(gè)體化檢驗(yàn)診斷技術(shù)方法的完善與改進(jìn),對(duì)個(gè)體化營養(yǎng)診療提供科學(xué)依據(jù)具有重要意義。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Thermo Scientifi 全波長(zhǎng)掃描多功能儀；島津高效液相色譜儀 LC-20AB，配熒光檢測(cè)器RF-20A；離心機(jī) Eppendorf；精密天平 METTLER TOLEDO XS205。

標(biāo)準(zhǔn)品，3-羥基吲哚硫酸鉀，純度≥98 %，CAS: 2642-37-7，Sigma-Aldrich 公司購買。

試劑，乙腈，色譜級(jí)，F(xiàn)isher Chemical 公司購買；乙酸，分析純，北京試劑公司購買。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取3-羥基吲哚硫酸鉀標(biāo)準(zhǔn)品(精確至 0.0001 g)，用純水定容，配制成濃度為500 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備溶液備用。然后將其稀釋，依次配制成濃度分別為5 mg/L，10 mg/L，25 mg/L，50 mg/L，100 mg/L，200 mg/L，250 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。

1.2.2 色譜條件

檢測(cè)波長(zhǎng)：激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm，發(fā)射波長(zhǎng)390 nm；色譜柱：Luna 5 μm C18 (2),250×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相及比例：乙腈﹕水=15﹕85，其中水為2 %的乙酸水溶液；流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃。

1.2.3 樣品的處理

采集的新鮮尿液樣品應(yīng)盡快置于-20 ℃冷凍保存。實(shí)驗(yàn)前，先將待測(cè)樣品置于室溫，待其解凍溶化后，以12000 轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘，取上清液過0.22 μm濾膜，稀釋10倍后待測(cè)。每個(gè)樣品進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)，剩余樣品置于-20 ℃冷凍保存(-20 ℃冷凍條件下，樣品可保存2周)。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 3-羥基吲哚硫酸鉀激發(fā)與發(fā)射波長(zhǎng)的選擇

3-羥基吲哚硫酸鉀標(biāo)準(zhǔn)品熒光光譜圖見圖1。

圖1 3-羥基吲哚硫酸鉀標(biāo)準(zhǔn)品熒光光譜圖a.激發(fā)波長(zhǎng)；b.發(fā)射波長(zhǎng)

由圖1可知，3-羥基吲哚硫酸鉀標(biāo)準(zhǔn)品的激發(fā)波長(zhǎng)為282 nm，發(fā)射波長(zhǎng)387 nm。

2.1.2 流動(dòng)相的選擇

比較了甲醇-水和乙腈-水，兩種流動(dòng)相對(duì)3-羥基吲哚硫酸鉀在Luna 5 μm C18色譜柱上分離效果的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明以乙腈-水作為流動(dòng)相可以得到更好的分離效果。然而，盡管使用了不同比例的乙腈-水對(duì)3-羥基吲哚硫酸鉀進(jìn)行分離，其出峰時(shí)間均在10分鐘之前，由于尿液樣品中同時(shí)含有其它多種代謝產(chǎn)物，因而無法使目標(biāo)峰與雜質(zhì)峰得到完全的分離。繼續(xù)研究了向流動(dòng)相中添加鹽類(50 mM的硫酸鈉)和添加酸類(2 %的乙酸)在色譜柱上分離的效果，發(fā)現(xiàn)添加2 %乙酸時(shí)，可以明顯延長(zhǎng)目標(biāo)峰的出峰時(shí)間，使樣品得到更佳的分離效果(見圖2和圖3)。

由于流動(dòng)相較純水中添加了乙腈、乙酸等有機(jī)溶劑，依據(jù)盡量減少雜質(zhì)峰干擾的原則，在實(shí)際檢測(cè)過程中采用激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm，發(fā)射波長(zhǎng)390 nm。

圖2 3-羥基吲哚硫酸鉀RF-HPLC色譜圖a.乙腈∶水=15∶85；b.乙腈∶水=15∶85，添加2 %乙酸

圖3 尿液樣品檢測(cè)的 RF-HPLC色譜圖乙腈∶水=15∶85，添加2 %乙酸

2.2 線性范圍、檢出限與精密度

采用優(yōu)化后的色譜條件對(duì)3-羥基吲哚硫酸鉀的線性范圍、檢出限以及精密度進(jìn)行了檢測(cè)。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，3-羥基吲哚硫酸鉀在研究范圍內(nèi)，即5.0 mg/L～250.0 mg/L均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，其線性相關(guān)系數(shù)為0.9993。方法的檢出限為0.001 mg/L，即該方法的靈敏度符合尿液樣品中尿靛甙含量測(cè)定的要求。取標(biāo)準(zhǔn)品溶液連續(xù)進(jìn)樣6針，記錄檢測(cè)結(jié)果，對(duì)精密度進(jìn)行檢測(cè)。由表1可以看出實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有良好的精密度。

表1 3-羥基吲哚硫酸鉀含量測(cè)定方法的精密度檢測(cè)結(jié)果

2.3 尿液樣品檢測(cè)與加標(biāo)回收率

為了驗(yàn)證本方法的準(zhǔn)確性，分別對(duì)3個(gè)不同濃度的尿液樣品進(jìn)行了檢測(cè)和加標(biāo)回收率的測(cè)定。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見表2)可知，該方法樣品檢測(cè)結(jié)果具有較好的平行性，其加標(biāo)回收率均在93 %～101 %之間。

表2 不同濃度尿液樣品中尿靛甙含量的檢測(cè)結(jié)果及其加標(biāo)回收率

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)室建立了高效液相色譜-熒光檢測(cè)法對(duì)尿液樣品中尿靛甙含量進(jìn)行測(cè)定的方法，對(duì)前處理方法和色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化。該方法適用于檢測(cè)人體尿液樣品中尿靛甙的含量，彌補(bǔ)了現(xiàn)有的顯色測(cè)定法前處理復(fù)雜、靈敏度低的缺點(diǎn),具有前處理簡(jiǎn)單易行，靈敏度高，檢出限低等優(yōu)點(diǎn)。該方法可應(yīng)用于個(gè)體化的檢驗(yàn)診斷,為推進(jìn)個(gè)體化營養(yǎng)診療提供重要的數(shù)據(jù)支持與科學(xué)依據(jù)。

[1] Sarnatskaya V V, Lindup W E, Niwa T. Effect of protein-bound uraemic toxins on the thermodynamic characteristics of human albumin. Biochem Pharmacol, 2002, 63( 7):1287-1296.

[2] 仲曉慧，岳虹霓，李艷，耿微，顏士偉.不同血型孕婦尿靛甙的臨床探討，現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2012，21( 5)，468-469.

[3] 張振宇，張啟芬，王群，談桂鳳，黃峰，張冬香，黃華，張建平.尿靛甙檢測(cè)在指導(dǎo)個(gè)體化飲食營養(yǎng)中的應(yīng)用研究，南通大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，30(4)，245-247.

[4] 謝鑫友，個(gè)體化醫(yī)學(xué)背景下的個(gè)體化檢驗(yàn)診斷，現(xiàn)代實(shí)用醫(yī)學(xué)，2011，23(10)，1084-1086.