高速逆流色譜-重結晶法制備高純度三尖杉寧堿和紫杉醇

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(1. 北京市理化分析測試中心，有機材料檢測技術與質量評價北京市重點實驗室，北京 100089；2.北京市食品安全分析測試工程技術研究中心，北京 100089)

紫杉醇(化學結構如圖1所示)是近20年來發現的重要的抗癌藥物，在天然植物中含量極低[1]，是從紅豆杉屬植物樹皮中提取的一種三環二萜類化合物[2]，因其抗癌作用機理獨特[3]，對卵巢腫瘤、乳腺腫瘤[4]等有非常獨特的療效，從而引起人們的廣泛關注。三尖杉寧堿(化學結構如圖1所示)是紫杉醇的紫杉烷類同系物，可以經過結構修飾轉化為紫杉醇，因此也是紫杉醇半合成制備的重要前體，同樣具有獨特的抗癌效果。因為紫杉醇與三尖杉寧堿化學結構十分相似，在制備過程中往往很難將這兩種物質分離開[5]。因此，對紫杉醇和三尖杉寧堿的高純度制備技術顯得尤為迫切。

圖1 三尖杉寧堿(左)和紫杉醇(右)結構圖

高速逆流色譜技術(high-speed counter-current chromatography, HSCCC)是一種新型的液-液分配色譜技術[6]，其與固-液色譜相比，具有高效、快速、操作簡單、回收率高、制備量大的優點，已經被廣泛應用于天然產物的分離純化和食品原料的開發利用等領域[7]。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

HSCCC-TBE300高速逆流色譜儀(上海同田生物技術股份有限公司)；LC-20A高效液相色譜儀(日本島津公司)；液相色譜-四極桿靜電場軌道阱質譜連用儀Utimate 3000(賽默飛世爾公司)；EYELA-N1100旋轉蒸發儀(上海愛朗儀器有限公司)；KQ-250E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；BS224S電子天平(賽多利斯科學儀器有限公司)；1000 μL微量可調移液器(Eppendorf公司)。

紫杉醇粗提物(陜西森弗天然制品有限公司)；紫杉醇對照品、三尖杉寧堿對照品(中國食品藥品檢定研究院)；正己烷、甲醇、乙酸乙酯、乙醇、二氯甲烷，均為分析純(北京化學試劑公司)；乙腈，色譜純(美國Fisher Scientific公司)。

1.2 高效液相色譜(HPLC)分析條件

色譜柱Inertsil ODS-SP C18(5μm, 150×4.6mm i.d.)，0～0min，乙腈∶水=50∶50等度洗脫，流速1mL/min，柱溫：30℃，檢測波長：227nm，分析時間：20min。進樣量10 μL

1.3 對照品溶液的配制

精密稱取紫杉醇和三尖杉寧堿對照品各1 mg，以色譜純乙腈溶解，于10 mL的容量瓶中定容，分別配制成0.1 mg/mL的紫杉醇和三尖杉寧堿對照品溶液。

1.4 高速逆流色譜和重結晶實驗條件

根據文獻[8]所述采用正己烷-醋酸乙酯-甲醇-乙醇-水(5∶7∶5∶1∶6.5，v/v)體系，利用常規HSCCC法分離紫杉醇和三尖杉寧堿，取得了一定效果，但未將兩者完全分開。本實驗采用同樣采用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-乙醇-水(5∶7∶5∶1∶6.5，v/v)體系，L-I-T的洗脫模式，轉速900 r/min，流速2 mL/min，檢測波長254 nm。下相溶解紫杉醇粗提物200 mg，進行高速逆流色譜法分離。

將高速逆流色譜法分離所得餾分去除溶劑后，以80℃濃度為50%乙腈溶解餾出物，形成飽和溶液，之后使其慢慢降溫，降溫至4℃后，以結晶漏斗過濾，回收晶體。

2 結果與分析

紫杉醇提取物經一步高速逆流色譜分離純化譜圖如圖2所示。

圖2 高速逆流色譜法分離純化紫杉醇提取物譜圖，檢測波長為254 nm

用錐形瓶收集圖2中指示的峰出來的液體，減壓蒸餾去除溶劑后，用乙腈溶解后，用高效液相色譜儀測定樣品純度，如圖3所示。

圖3 紫杉醇提取物分離純化前后高效液相色譜圖A.紫杉醇提取物色譜圖； b.圖1所示A餾分色譜圖；c.圖1所示B餾分色譜圖；d.三尖杉寧堿對照品色譜圖；e.紫杉醇對照品色譜圖

將紫杉醇粗提物、A、B餾分的高效液相色譜圖與三尖杉寧堿和紫杉醇的對照品色譜圖進行比對，可確認A組分主要成分為三尖杉寧堿，B組分主要為紫杉醇。通過峰面積歸一化法，三尖杉寧堿和紫杉醇的純度見表1所示，測得紫杉醇粗提物中，三尖杉寧堿和紫杉醇純度分別為：33.1%和36.5%，組分A的三尖杉寧堿純度為88.4%，組分B的紫杉醇純度為89.7%。高速逆流色譜法分離紫杉醇粗提物一次性能得到純度較高的三尖杉寧堿和紫杉醇組分，但依然有少量雜質難以去除。

將組分A、B溶劑去除后以50%乙腈分別對其進行重結晶，將結晶后的樣品回收，用乙腈溶解后，進行高效液相色譜分析，如圖3、4所示。經重結晶后，A組分的三尖杉寧堿純度為98.7%，B組分的紫杉醇純度為97.6%。

表1 三尖杉寧堿和紫杉醇的分離純化結果表

圖3 組分A經重結晶后的高效液相色譜圖

圖4 組分B經重結晶后的高效液相色譜圖

將最終由重結晶得到的三尖杉寧堿和紫杉醇樣品，經液相色譜-四極桿靜電場軌道阱質譜連用儀Utimate 3000進行正離子模式測定，測定結果如圖5、6所示。三尖杉寧堿分子式為C45H53NO14，分子量為831.91，經儀器測定正離子模式下分子量為832.35449，分子式鑒定為C45H54NO14+，數值上與三尖杉寧堿相吻合；紫杉醇的分子式為C47H51NO14，分子量為853.91，經儀器測定正離子模式下分子量為876.32092，分子式鑒定為C45H54NO14Na+，數值上與紫杉醇吻合。

圖5 三尖杉寧堿高分辨質譜圖

圖6 紫杉醇高分辨質譜圖

3 結論

紫杉醇粗提物中三尖杉寧堿和紫杉醇純度分別為33.1%和36.5%，高速逆流色譜法一步分離純化紫杉醇粗提物可以有效將三尖杉寧堿和紫杉醇進行分離，得到的三尖杉寧堿和紫杉醇餾分純度分別為88.4%和89.7%，重結晶可以進一步提高三尖杉寧堿和紫杉醇的純度，重結晶后三尖杉寧堿和紫杉醇純度可以分別達到98.7%和97.6%。所制備樣品經過質譜數據驗證，符合三尖杉寧堿和紫杉醇的分子量。

[1]常醉, 郭娜, 劉彤, 等. 天然東北紅豆杉中紫杉醇和三尖杉寧堿含量的分布及變化規律[J]. 中國中藥雜志, 2011, 36(3): 294-298.

[2]董慧茹, 雒麗娜, 鄭云, 等. 薄層色譜法分離紫杉醇和三尖杉寧堿[J]. 理化檢驗-化學分冊, 2007, 43(6): 472-475.

[3]劉同祥, 張艷平, 徐羽, 等. 紫杉醇聯合三尖杉寧堿誘導人肝癌HepG2細胞凋亡[J]. 中國實驗方劑學雜志, 2010, 16(9): 115-118.

[4]陳小芬, 黃新異, 鄭媛媛, 邸多隆. 高速逆流色譜分離純化天然產物中生物堿類成分的應用進展[J]. 中草藥, 2011, 42(5): 1026-1032.

[5]盧建偉. 加拿大紅豆杉中紫杉醇提取分離工藝及含量測定研究[D]. 長春: 吉林農業大學, 2009: 13.

[6]易建華, 潘毛頭, 朱振寶. 高速逆流色譜分離純化紫甘藍花色苷[J]. 食品與機械, 2012, 28(6): 129-132, 213.

[7]徐佳茗, 夏學軍, 劉玉玲. 紫杉醇新型制劑及臨床研究進展[J]. 實用藥物與臨床, 2016, 19(4): 510-517.

[8]蘇靜, 談鋒, 謝峻, 等. 循環高速逆流色譜從曼地亞紅豆杉枝葉提取物中分離紫杉醇和三尖杉寧堿[J]. 中草藥, 2009, 40(10): 1569-1572.