超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定大豆中草甘膦及其代謝物氨甲基膦酸的殘留

(黑龍江省農(nóng)墾科學(xué)院測(cè)試化驗(yàn)中心，佳木斯 154007 )

草甘膦(Glyphosate，PMG)又名鎮(zhèn)草寧、農(nóng)達(dá)，分子式為C3H8NO5P，是1971年美國(guó)孟山都公司研發(fā)的一種有機(jī)磷除草劑，因其兼具內(nèi)吸、傳導(dǎo)性、滅生性及非選擇性，同時(shí)不易在生物體內(nèi)累積，故廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中一年生和多年生雜草防除，是目前世界上應(yīng)用最廣、生產(chǎn)量最大的除草劑[1,2]。草甘膦及其在植物中的主要代謝物氨甲基膦酸(Aminomethyl-phosphonic acid，APMA，分子式為CH6NO3P)均屬于強(qiáng)極性、易溶于水的高沸點(diǎn)化合物，具有不易揮發(fā)、無紫外吸收等特性，因此用常規(guī)方法分析檢測(cè)十分困難[3]。

目前， PMG和APMA殘留檢測(cè)的方法主要有色譜法(GC[4]、LC[5]、IC[6])、質(zhì)譜法(GC/MS[7]、ICP/MS[8]、LC/MS/MS[9-13])、光譜法[14]等。光譜法雖然操作簡(jiǎn)便，但其靈敏度不高，而離子色譜法[6]只能適用于水樣等簡(jiǎn)單基質(zhì)，用于植物源樣品檢測(cè)時(shí)干擾太大；用氣相色譜和氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)時(shí)，需要將PMG和APMA衍生轉(zhuǎn)化為可氣化物質(zhì)，其引入試劑多、過程相對(duì)繁瑣，效率較低[4,7]；用LC/MS/MS法直接檢測(cè)時(shí)[13]，由于PMG和APMA分子量(分別為169、111)均較小，其主要碎片離子的質(zhì)荷比多在100以下，檢測(cè)實(shí)際樣品時(shí)受基質(zhì)干擾嚴(yán)重，靈敏度較低，因此柱前衍生——液質(zhì)聯(lián)用法成為近年來國(guó)內(nèi)外檢測(cè)PMG和APMA殘留的主流方法[9-12]。以9-芴甲氧羰酰氯(FMOC-Cl)做為衍生試劑，在硼酸鹽緩沖溶液中與PMG和APMA水提取液相容性好，過程簡(jiǎn)單，其衍生產(chǎn)物在LC/MS/MS中響應(yīng)信號(hào)高，碎片離子干擾小，適合定性定量分析。

目前，采用柱前衍生—LC/MS/MS法檢測(cè)茶葉、稻米等基質(zhì)中PMG和APMA殘留的報(bào)道很多[9-13]，專門針對(duì)大豆基質(zhì)的報(bào)道很少。行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[15]的適用范圍雖然包括了大豆基質(zhì)，但該方法在實(shí)驗(yàn)過程中試劑用量大、操作繁瑣(反復(fù)調(diào)pH值)、衍生時(shí)間長(zhǎng)(需過夜)，尤其是使用陽(yáng)離子交換柱(CAX)洗脫時(shí)需要加入11 mL 1%的鹽酸甲醇水(20/80，v/v)，水分含量過高導(dǎo)致旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)時(shí)很難蒸干，容易造成PMG和APMA回收率不穩(wěn)定。本文專門針對(duì)大豆這類高蛋白、高脂肪含量的特殊基質(zhì)，采用純水作為提取試劑，二氯甲烷去除脂溶性雜質(zhì)，C18固相萃取小柱凈化后采用FMOC-Cl衍生，最后用UPLC/MS/MS測(cè)定。該方法前處理過程簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高，適用于大豆中PMG和APMA的殘留檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與試劑

草甘膦、氨甲基膦酸(純度≥99%，德國(guó)Dr.Ehrensorfer公司)；FMOC-Cl(純度>99%，Sigma公司)，使用時(shí)配置成10g/L的丙酮溶液；乙腈、二氯甲烷、甲酸、乙酸銨(色譜純，美國(guó)Fisher公司)；十水四硼酸鈉(優(yōu)級(jí)純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)，使用時(shí)配置成50g/L的水溶液；實(shí)驗(yàn)用水為Millipore純水儀制備；C18固相萃取小柱(200mg/3ml，美國(guó)Agilent公司)。

1.2 儀器與設(shè)備

Acquity UPLC型超高效液相色譜儀(Waters公司)；XEVO TQ-S三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀(Waters公司)；CR21GⅢ型高速離心機(jī)(HITACHI公司)；KQ5200DB型臺(tái)式超聲波儀(昆山市超聲儀器有限公司)；渦旋混合器(IKA公司)。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置

分別稱取草甘膦和氨甲基膦酸標(biāo)準(zhǔn)品10mg(精確到0.1mg)，用水溶解并定容至10mL，配置成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于4℃冰箱保存待用；使用時(shí)用水逐級(jí)稀釋成所需濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.4 樣品前處理

提取：稱取粉碎均勻后的試樣1.0g(精確到0.01g)于50mL聚乙烯離心管中，加入10.0mL超純水，渦旋混合30 s并超聲提取20 min后，以10000 r/min離心3 min，將上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中，加入5 mL二氯甲烷渦旋混合30 s，以10000 r/min離心3 min，上清液待凈化。

凈化：取2.5 mL上清液加入到C18固相萃取柱(使用前依次用3mL甲醇和3mL超純水活化)中，棄去最初的幾滴流出液(約0.5 mL)，將剩余部分用5 mL玻璃管收集，待衍生。

衍生：取1.0 mL凈化液于5 mL離心管中，依次加入1.0 mL 50g/L的硼酸鈉溶液和1.0 mL 10g/L的FMOC-Cl衍生液，混勻后室溫下衍生2 h，以10000 r/min離心3 min，取上清液過0.22m有機(jī)系微孔濾膜后，供UPLC/MS/MS分析測(cè)定。

1.5 液相色譜及質(zhì)譜條件

液相色譜：色譜柱:WatersBEH C18(1.7 μm，50mm×2.1mm)；柱溫：30℃；流速：0.5 mL/min；進(jìn)樣量：2 μL；流動(dòng)相A：乙腈；流動(dòng)相B： 2 mmol /L 的乙酸銨水溶液。梯度洗脫程序：0～0.5min，10% A；0.5～3. 0 min，10%～100% A；3. 0 ～4. 0 min，100%A，4 ～4.1min，100% A～10% A，4.1 ～5.0min 10% A。

質(zhì)譜：離子源：電噴霧離子源( ESI+) ；掃描方式：正離子掃描；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)( MRM)；毛細(xì)管電壓：3.2 kV；離子源溫度：150℃；去溶劑氣溫度：500℃；去溶劑氣流量：1000 L /h；定性、定量離子對(duì)及碰撞能量見表1。

表1 PMG-FMOC和 AMPA-FMOC的MRM質(zhì)譜參數(shù)

﹡quantitative ion

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜及質(zhì)譜條件的優(yōu)化

流動(dòng)相的選擇：對(duì)比了酸性體系(0.1%甲酸水溶液)與非酸性體系(乙酸銨水溶液)分別于甲醇、乙腈的流動(dòng)相體系組合，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種分析物在酸性體系中分離效果欠佳，峰形拖尾嚴(yán)重，而在非酸性體系中其色譜分離效果得到明顯改善，峰形對(duì)稱；乙腈比甲醇體系洗脫能力更強(qiáng)，可以有效縮短分析時(shí)間。故本研究采用乙酸銨水溶液+乙腈流動(dòng)相體系，并比較了1、2、5 mmol/L三種乙酸銨濃度與乙腈的組合，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著乙酸銨濃度的增加，目標(biāo)物響應(yīng)值雖略有提高但相差不大，而同時(shí)儀器背景值卻顯著升高，綜合考慮目標(biāo)物信號(hào)強(qiáng)度、信噪比、色譜分離效果以及分析時(shí)間等因素，本實(shí)驗(yàn)最終選擇了2 mmol /L 乙酸銨水溶液+乙腈分析體系。

質(zhì)譜的選擇：PMG、 AMPA對(duì)應(yīng)的衍生物PMG-FMOC、AMPA-FMOC分子量分別為391、333。用超純水配置10 mg/L 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液直接注射到質(zhì)譜中，在正負(fù)離子模式下分別進(jìn)行母離子全掃描，發(fā)現(xiàn)正離子模式下392、334具有很好的響應(yīng)，然后分別以392、334為母離子進(jìn)行子離子全掃描，各得到兩組豐度高、干擾小的子離子對(duì)進(jìn)行MRM監(jiān)測(cè)，最終確定的質(zhì)譜條件見表1。

2.2 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

提取溶液的選擇：PMG和APMA屬于強(qiáng)極性物質(zhì)，易溶于水，難溶于有機(jī)溶劑，故一般采用極性溶劑提取，如純水及KOH、NaHCO3溶液等[9-14]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，用堿性溶液提取后，大豆中脂肪、蛋白等物質(zhì)會(huì)與堿性物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致離心后的提取液異常渾濁，不利于后期凈化和衍生，因此本實(shí)驗(yàn)采用純水作為提取試劑，再經(jīng)二氯甲烷液液萃取去除脂溶性雜質(zhì)。

凈化柱的選擇：研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)提取后的溶液不經(jīng)SPE凈化直接進(jìn)行衍生， PMG和APMA的回收率均不足30%，且精密度很差，這可能是由于大豆中富含脂肪、蛋白質(zhì)等物質(zhì)干擾衍生過程，故本實(shí)驗(yàn)比較了對(duì)脂肪、蛋白質(zhì)有很好去除效果的C18、中性Al2O3、HLB固相萃取SPE柱的凈化效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)提取液經(jīng)中性Al2O3凈化后，PMG和APMA幾乎檢測(cè)不到；而C18凈化后目標(biāo)物回收率為92.7%、90.8%，HLB為83.6%、80.5%。故本實(shí)驗(yàn)選取了凈化效果更好，成本相對(duì)低廉的C18固相萃取小柱。

衍生條件的優(yōu)化：FMOC-Cl的衍生機(jī)制是在堿性環(huán)境下(pH=9.0)通過FMOC-Cl基團(tuán)取代目標(biāo)化合物氮原子上的氫，從而生成較穩(wěn)定的化合物FMOC-Cl。參照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[15]及文獻(xiàn)報(bào)道[9-12]所選用的緩沖液濃度，本實(shí)驗(yàn)采用50g/L的硼酸鈉水溶液緩沖液體系，設(shè)置的衍生試劑質(zhì)量濃度為1、2、5、10、20 g/L FMOC-Cl丙酮溶液，按照本文1.4步驟對(duì)PMG和APMA質(zhì)量濃度為0.5 mg/L的純水溶液和大豆空白基質(zhì)溶液分別進(jìn)行衍生，結(jié)果見圖1。結(jié)果表明，在純水溶液中，F(xiàn)MOC-Cl濃度為2 g/L時(shí)，PMG和APMA的峰面積已達(dá)到最大，隨著衍生化試劑濃度的升高，其峰面積無明顯變化；而在大豆空白基質(zhì)溶液中，F(xiàn)MOC-Cl低濃度(1、2g/L)時(shí)，PMG和APMA幾乎檢測(cè)不到，其峰面積隨衍生化試劑濃度增加而加大，濃度到達(dá)一定程度(10 g/L)時(shí)，峰面積不再變化。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因，可能是由于盡管大豆提取液經(jīng)過了二氯甲烷和C18小柱的凈化，但還是會(huì)有少量水溶性蛋白、脂肪等雜質(zhì)殘留在凈化液中，這些雜質(zhì)可能會(huì)與衍生試劑反應(yīng)，影響目標(biāo)物的衍生效果。研究還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)FMOC-Cl濃度為20 g/L時(shí)，得到的PMG和APMA色譜峰產(chǎn)生拖尾現(xiàn)象，可能是由于衍生試劑化學(xué)性質(zhì)較活潑，其用量大時(shí)，過量的FMOC-Cl會(huì)迅速轉(zhuǎn)化成FMOC-OH，干擾目標(biāo)物峰形。在50g/L硼酸鈉水溶液、10 g/L FMOC-Cl丙酮溶液條件下，考察不同時(shí)間(0.5h、1h、2h、4h、8h和16h)對(duì)衍生效果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2 h后PMG和APMA的測(cè)定值無明顯增加。因此，本實(shí)驗(yàn)最終選定的衍生條件為50g/L硼酸鈉水溶液、10 g/L FMOC-Cl丙酮溶液，室溫下衍生2 h。

圖1 衍生試劑濃度對(duì)不同基質(zhì)中PMG和APMA衍生效率的影響

2.3 基質(zhì)效應(yīng)的考察

基質(zhì)效應(yīng)(主要是抑制)是LC/MS/MS儀器檢測(cè)時(shí)經(jīng)常遇到的現(xiàn)象。由于本實(shí)驗(yàn)采用極性很強(qiáng)的水作為提取劑，大豆中的色素、脂肪酸等極性較強(qiáng)的物質(zhì)也有少部分進(jìn)入到最后的上機(jī)液中，在離子化帶電過程中會(huì)與目標(biāo)物產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)，抑制目標(biāo)物的離子化效率。實(shí)驗(yàn)考察了用PMG和APMA的純水標(biāo)樣去標(biāo)定經(jīng)過本文1.4步驟處理后的大豆空白基質(zhì)溶液配置的同濃度標(biāo)樣，其色譜圖見圖2。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PMG在純水和大豆空白基質(zhì)中峰面積基本一致，而APMA在大豆空白基質(zhì)中的峰面積僅為純水中的55.7%，產(chǎn)生了明顯的基質(zhì)抑制效應(yīng)。為了消除基質(zhì)干擾，本實(shí)驗(yàn)選用大豆樣品空白基質(zhì)配置不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液來繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行校準(zhǔn)。

圖2 PMG和APMA標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.02 mg/L)MRM色譜圖

2.4 線性范圍和定量限

用大豆空白基質(zhì)溶液分別配置0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.2、0.5 mg/L的PMG和APMA混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按本文1.4步驟衍生后測(cè)定，以各自定量離子的峰面積為Y對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度X(mg/L)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到的線性方程和相關(guān)系數(shù)見表2。結(jié)果表明，這兩種物質(zhì)在0.001～0.5 mg/L濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)R分別為0.9996和0.9993。以10倍信噪比(S/N)計(jì)算，該方法PMG和APMA的定量限(LOQ)均為0.01 mg/kg。

表2 PMG和APMA大豆基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的線性方程、相關(guān)系數(shù)和定量限(LOQ)

2.5 回收率和精密度

稱取大豆空白試樣1.0 g，分別添加0.02、0.2、2 mg/kg水平的PMG和APMA混合標(biāo)樣，每個(gè)水平重復(fù)6次，按照本文1.4步驟前處理方法處理后上機(jī)檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。從表3可以看出，PMG的平均回收率為80.2%～91.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD，n=6)為3.37%～6.96%；APMA的平均回收率和RSD分別為77.7%～89.3%和4.11%～8.27%。

表3 大豆中PMG和APMA的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

3 結(jié)語(yǔ)

本文建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC/MS/MS)測(cè)定大豆中草甘膦及其代謝物氨甲基膦酸殘留的分析方法。該方法靈敏度高，PMG和APMA定量限(LOQ)達(dá)到0.01 mg/kg，能滿足大豆產(chǎn)品相關(guān)限量標(biāo)準(zhǔn)要求。同時(shí)該方法具有較高的準(zhǔn)確度和精密度，前處理步驟簡(jiǎn)單快速，特別適合大批量大豆樣品的檢測(cè)。

[1]蘇少泉,滕春紅. 草甘膦應(yīng)用現(xiàn)狀與未來發(fā)展[J].世界農(nóng)藥, 2014,36(3):8-11.

[2]Botero A M, Ibanez M, Sancho J V, et al. Direct liquid chromatography-tandem mass spectrometry determination of underivatized glyphosate in rice, maize and soybean[J]. Journal of Chromatogrraphy A, 2013, 1313: 157-165.

[3]Goodwin L, Startin J R, Kelly B J, et al. Analysis of glyphosate and glufosinate by capillary electrophoresis-mass spectrometry utilizing a sheathless microelectrospray interface[J]. Journal of Chromatogrraphy A, 2003, 1004: 107-119.

[4]胡繼業(yè),趙殿英,寧君,等. 氣相色譜-氮磷檢測(cè)器測(cè)定草甘膦在土壤和蘋果中的殘留量[J].農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào), 2007, 9(3):285-290.

[5]杭學(xué)宇,汪怡,王芹,等. 柱前衍生-固相萃取-高效液相色譜熒光法測(cè)定蔬菜中草甘膦[J]. 食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào),2016,7(5):1822-1826.

[6]邱慧敏, 耿金菊, 韓超, 等. 串聯(lián)毛細(xì)管離子色譜法測(cè)定水中亞磷酸根、磷酸根、草甘膦和氨甲基膦酸[J].分析化學(xué), 2013(12):1910-1914.

[7]AOAC Official Method 2000.05. Determination of Glyphosate and Aminomethylphosphonic Acid in Crops, 2000.

[8]Guo Z X, Cai Q T, Yang Z G. Determination of glyphosate and phosphate in water by ion chromatography-inductively coupled plasma mass spectrometry detection[J].Journal of Chromatogrraphy A,2005,1100: 160-167.

[9]吳曉剛, 陳孝權(quán), 肖海軍, 等. 柱前衍生-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)檢測(cè)茶葉中草甘膦和草銨膦的殘留量[J].色譜, 2015(10):1090-1096.

[10] 馮月超,馬立利,賈麗, 等.多壁碳納米管分散固相萃取-液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)測(cè)定茶葉中草甘膦、草銨膦、氨甲基膦酸殘留量[J]. 食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào), 2014, 5(4):1147-1154.

[11]諸力,陳紅平,周蘇娟, 等. 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定不同茶葉中草甘膦、氨甲基膦酸及草銨膦的殘留[J]. 分析化學(xué), 2015(2):271-276.

[12] 曹趙云, 牟仁祥, 陳銘學(xué). 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定稻米中的草甘膦和氨甲基膦酸殘留[J].色譜, 2010, 28(8):743-748.

[13]周爽, 徐敦明, 林立毅, 等. 反反相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法直接測(cè)定植物源性食品中草甘膦及其代謝物殘留[J]. 分析測(cè)試學(xué)報(bào),2013, 32(2):199-204.

[14]李國(guó)鵬, 周彩榮, 石曉華, 等. 分光光度法測(cè)定草甘膦生產(chǎn)廢水中草甘膦和甘氨酸的含量[J]. 鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)(理學(xué)版) ,2012, 44(2):81-84.

[15] SN/T 1923-2007進(jìn)出口食品中草甘膦殘留量的檢測(cè)方法 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法.