便攜式血糖儀對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌mecA基因的靈敏檢測方法研究

*

(1. 重慶醫科大學臨床檢驗診斷學教育部重點實驗室，重慶 400016；2. 重慶醫科大學附屬第一醫院體檢中心，重慶 400016)

1 引言

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌 ( methicillin-resistantStaphylococcusaureus, MRSA) 是引起院內感染的重要病原菌[1]。除對甲氧西林耐藥外，MRSA對常用的抗生素如β內酰胺類抗生素、氨基糖甙類抗生素、大環內酯類抗生素等均具有抗性，并可引起敗血癥、壞死性肺炎和中毒性休克綜合征等危及生命的感染性疾病[2-4]。因此，MRSA菌株的可靠檢測對于指導感染早期階段的有效治療至關重要[5]。迄今為止，MRSA鑒定的檢測方法主要是基于培養的標準微生物學方法和實時聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction, PCR)。然而，基于培養MRSA的微生物檢測方法存在靈敏度低，操作復雜且耗時(24～72小時)等不足[6]。雖基于PCR的基因檢測方法因其高靈敏度和高時效而被認為是“金標準”，但仍然存在儀器設備昂貴和標本易交叉污染等缺點[7]。因此，開發一種方便且敏感檢測MRSA的新方法依然很有必要。

DNA檢測已普遍用于病原體分析、遺傳疾病診斷和法醫檢測[8]。mecA(methicillin determinant A) 是染色體上編碼青霉素結合蛋白的基因，其與MRSA耐藥性密切相關，因而成為MRSA識別的“金標準”[9]。在本研究中，將編碼青霉素結合蛋白基因mecA作為檢測目標(Target)。

納米技術的出現為通過信號放大策略檢測生物分子開辟了新的途徑[10]。金納米粒子(AuNPs)是一種穩定的納米材料，擁有很好的生物相容性，它可以與很多生物分子共軛結合并且不改變這些分子的性質和活性。為了提高金納米粒子表面生物分子的結合率，Esumi K等[11]合成了以PAMAM dendrimers 聚合物作為載體的納米金功能化的樹狀大分子，Qiu等[12]基于納米金功能化的樹狀大分子，將多個辣根過氧化物酶通過金硫鍵與金氨鍵固定在聚樹狀大分子上，從而實現了對環境中汞離子的靈敏檢測。鑒于此，該研究工作欲引入納米金功能化樹狀大分子以提高酶性分子載量，實現信號放大。

血糖儀由于其便攜性，快速測定，低成本和操作簡單等特點而受到了廣泛關注[13]。目前，基于個人血糖儀已經實現了多種目標物的檢測。Yu Xiang和Yi Lu[14]利用個人血糖儀結合功能DNA傳感器實現了對鈾離子、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)、可卡因、干擾素-γ等分析物的檢測。Qing Wang 等[15]使用適體和商業化的血糖儀對心臟生物標志物肌紅蛋白進行靈敏監測。

本工作將血糖儀與納米金功能化樹狀大分子二者優勢有機結合，利用血糖儀建立了一種基于蔗糖酶修飾的納米金功能化樹狀大分子對mecA基因的靈敏檢測方法，如圖1所示。將單鏈核酸DNA(MG1)通過親和素-生物素作用固定于鏈酶親和素修飾的磁珠表面，DNA(MG2)通過堿基互補配對與MG1部分結合，形成帶有toehold的DNA雙鏈。蔗糖酶通過其半胱氨酸以及賴氨酸殘基，而DNA(MG3)通過其巰基基團分別與金納米粒子相互作用，共同結合在納米金功能化樹狀大分子(Au-PAMAM)表面，形成蔗糖酶修飾的納米金功能化樹狀大分子(Invertase-labeling gold-dendrimer)。蔗糖酶修飾的納米金功能化樹狀大分子通過信號核酸探針MG3與核酸MG2的toehold雜交結合，從而把修飾有蔗糖酶的納米金功能化樹狀大分子固定在磁珠表面。當檢測靶基因存在的條件下，其與捕獲核酸探針MG2特異性結合，將蔗糖酶修飾的納米金功能化樹狀大分子置換下來，經磁場分離后，上清液中存在的蔗糖酶催化底物蔗糖產生可直接檢測的葡萄糖信號，實現血糖儀對mecA基因的定量檢測。

圖1 基于蔗糖酶修飾的納米金功能化樹枝狀分子對mecA 基因檢測原理圖

2 實驗部分

2.1 試劑與儀器

鏈酶親和素修飾的磁珠(平均直徑1 μm)，美國紐英倫生物技術有限公司；聚樹狀大分子(乙二胺核，5.0代，甲醇中含量5 wt%)，四氯代氫金合四水化物(HAuCl4.4H2O)，酵母蔗糖酶(Grade Ⅶ invertase from baker’s yeast)，NaBH4，美國西格瑪公司；Tris-HCl 緩沖液(1 M, pH 7.4) ，PBS緩沖液(0.01 M, pH 7.2-7.4)，纖維素透析袋(分子量截留值為12,000-14,000)，北京索萊寶科技有限公司；三氯乙基磷酸酯(TCEP)，核酸，上海生工生物工程有限公司。

Target: 5′-ATT GGG ATC ATA GCG TCA TTA-3′；

磁珠結合的核酸MG1:5′-TCA CAG ATG AGT AAA AAA AAA AAA-biotin- 3′；

捕獲核酸探針MG2:5′-TTT TTT ACT CAT CTG TGA TAA TGA CGC TAT GAT CCC AAT-3′；

信號核酸探針MG3：5′-HS-AAA AAA AAA AAA ATC ATA GCG TCA TTA-3′；

活力型血糖儀：ACCU-CHEK Active，羅氏公司；紫外可見吸收光譜儀：NANO-DROP1000，美國賽默飛世爾科技公司；透射電子顯微鏡：H600，日本日立公司；電化學工作站：CHI660D，上海辰華儀器有限公司；電泳儀：DYY-6C，北京市六一儀器廠；成像儀：美國伯樂公司。

2.2 納米金樹枝狀分子(Au-PAMAM)的制備

Au-PAMAM根據基于聚樹狀大分子為模板的原位還原法制備[16]。首先，將新鮮制備的HAuCl4溶液(10 mL, 20 mM)與2 mL超純水加入12.5 mLPAMAM溶液中，同時混合溶液攪拌1 h。然后將新鮮制備并儲存于4 ℃中的NaBH4迅速加入到上述溶液中，并攪拌反應30 min。當溶液的顏色從淺黃色變為紅褐色時說明Au-PAMAM已經形成。在這個過程中，吸附于PAMAM樹狀大分子上的Au(Ⅲ)被還原為零化合價的Au0。隨后，透析除去雜質和游離的金納米顆粒。最后將以上制備的Au-PAMAM復合物分散于5 mL超純水中，并置于棕色瓶中4℃ 儲存。

2.3 蔗糖酶與DNA修飾的納米金功能化樹狀大分子的制備

利用蔗糖酶上的半胱氨酸或賴氨酸殘基與金納米粒子間的相互作用，以及DNA上的巰基基團與金納米粒子間的相互作用制備得到蔗糖酶與DNA修飾的納米金功能化樹狀大分子[16]。首先，將蔗糖酶(40 μL , 1.0 mg/mL)加入到200 μLAu-PAMAM與200 μLPBS(0.01 M, pH 7.4)共400μL的混合液中，并于4 ℃條件下孵育30 min。隨后10 μL 的1.0 μM信號核酸MG3(溶液含有10 mM Tris-HCl，10 mM TCEP， 0.1 M NaCl，pH 7.4)加入到上述混合液中，并于同樣的條件下孵育4 h(注意：在MG3修飾在金納米粒子表面之前，巰基化的MG3需要經過TCEP于室溫條件下預處理1 h，以還原形成的二硫化物)。

2.4 適配體磁珠(MG2-MB)的制備

取30 μL 4 mg/mL的鏈霉親和素磁珠溶液，用PBS緩沖液洗3次。然后將4 μL100uM(終濃度3.2 μM)的MG1加至30 μL磁珠溶液中，于37 ℃下孵育30 min，然后磁分離，洗去過量的MG1；緊接著4 μL100 μM的適配體核酸MG2加入磁珠中，并在37℃下反應30 min，磁分離，除去過量的MG2。最終將制備的MG2-MB分散于120 μLPBS溶液中。

2.5 蔗糖酶修飾的磁珠復合物(I-MB)的制備

120μL的磁珠溶液去除緩沖液后，60 μL的Au-PAMAM復合物溶液加入其中，混合液于37 ℃下反應1 h。經磁場分離后去除未結合的Au-PAMAM復合物(用PBS緩沖液清洗3次)，最后將制備好的I-MB分散于60 μL的PBS溶液中，并儲存于4 ℃備用。

2.6 基于金功能化樹狀大分子的血糖儀對靶基因的檢測

取10 μL 的I-MB，經磁場分離后加入10 μL不同濃度的靶基因，并于37 ℃孵育1 h。磁場分離后，取5 μL的上清液與1.7 μL的蔗糖(2 M)混合，并于37 ℃孵育16 h。最終取2 μL反應后的混合液用于血糖儀檢測。

3 結果與討論

3.1 Au-PAMAM的表征

采用透射電鏡(TEM)、電化學阻抗譜(EIS)和紫外可見吸收光譜(UV-vis)對Au-PAMAM 進行形態學表征。如圖2A所示，Au-PAMAM 的透射結果顯示，其平均尺寸約3 nm。采用EIS對合成的Au-PAMAM 進行表征，可見裸金電極其電荷轉移值(charge transfer resistance, Rct)比較大(圖2B曲線c)；當裸金電極上修飾PAMAM后，由于PAMAM具有很強的電子傳遞能力，其Rct幾乎成一條直線(曲線a)；而當Au-PAMAM固定在裸金電極上時，其Rct稍有增加，位于單純的PAMAM與裸金電極之間(曲線b)。同時，采用紫外可見吸收光譜對PAMAM與Au-PAMAM進行表征(圖2C)。單純的PAMAM特征性吸收峰在283 nm處，當金納米粒子原位還原在PAMAM上形成Au-PAMAM后，其特征性吸收峰由單峰變成了雙峰，分別是286 nm與520 nm。結果與之前報道的相一致[15-16]。這些結果都表明金納米粒子在PAMAM上已經還原成功。

圖2 Au-PAMAM的光學與電化學表征A.Au-PAMAM的透射電鏡圖；B. EIS電化學表征圖：(a)PAMAM，(b) Au-PAMAM，(c)裸金；C. 紫外吸收光譜圖：(a) PAMAM，(b)Au-PAMAM

3.2 核酸雜交的瓊脂糖凝膠電泳表征

瓊脂糖凝膠電泳用以證實Target與MG2的雜交并釋放出MG3(圖3)。圖中條帶1到4分別表示Target，MG1，MG2和MG3。當MG1與MG2雜交后產生了新的條帶5，此產物進一步與MG3雜交后產生新的條帶6，條帶6中的雜交產物與靶DNA反應，產生新的條帶7。電泳結果顯示Target能與MG1、MG2和MG3形成的雜交產物反應。實驗中所用到的單鏈DNA濃度都是4 μM，雙鏈DNA濃度都是2 μM。

圖3 核酸雜交的電泳表征1.Target；2. MG1；3. MG2；4. MG3；5. MG1+MG2；6. MG1+MG2+MG3；7. MG1+MG2+Target

3.3 Target與鏈酶親和素修飾的磁珠上的捕獲核酸探針MG2雜交

為了進一步證明Target能夠與捕獲核酸探針MG2雜交并具有置換出修飾有蔗糖酶的單鏈信號核酸探針MG3的能力，制備了3種樣品。樣品A加入不含捕獲核酸探針的磁珠中進行血糖檢測，而含有不同濃度靶基因的樣品B(0.001 nM)與C(1 nM)加入含有捕獲核酸探針的磁珠中進行血糖檢測。正如圖4所示，以上樣品觀察到不同的血糖信號，這證明了該方法具有檢測靶基因的能力。

圖4 檢測方法可行性分析

3.4 實驗條件優化

為了使該檢測方法達到最佳的分析性能，實驗對DNA與蔗糖酶的比例、Au-PAMAM的濃度、Target的孵育時間以及實驗用的蔗糖濃度進行了優化。DNA與蔗糖酶的比例在該方法的檢測性能方面起著重要的作用，因為DNA濃度過高，結合的蔗糖酶量就會很少，相應的產生信號就比較低，而如果DNA濃度過低，結合在磁珠上的信號核酸比較少，檢測的血糖信號同樣也會較低，因此對DNA與蔗糖酶的比例進行研究尤為必要。如圖5A所示，隨著DNA與蔗糖酶濃度的比例增加，血糖信號急劇增加，在比例為1∶3時信號最大，超過此比例血糖信號下降，因此1∶3為最佳DNA與蔗糖酶濃度的比例。由于Au-PAMAM的濃度決定了其表面結合蔗糖酶的量，因此研究了其在稀釋5倍至100倍濃度下的檢測能力。如圖5B所示，當其稀釋倍數約為15倍時，達到最大的血糖信號，因此稀釋15倍的Au-PAMAM為其最佳濃度。Target的孵育時間對該檢測方法的最終結果也有很大的影響，如圖5C所示，孵育90 min時有一個最大峰，因此90 min作為我們的Target孵育時間。最后我們也研究了蔗糖濃度對血糖信號的影響(圖5D)，蔗糖濃度在0.2-0.6 M時，血糖信號增加，而蔗糖濃度過高時基本不變，因此，0.6 M作為蔗糖的最佳濃度。

圖5 實驗條件優化1.DNA與酶比例的優化影響；B. Au-PAMAM濃度的影響；C. Target孵育時間的影響；D. 蔗糖濃度的影響

4 檢測方法的分析性能評估

為了評估該檢測方法對靶基因的分析性能，實驗用一系列不同濃度的靶基因對本方法進行了研究。根據0.1 pM到10 nM不同濃度的Target檢測到的結果顯示在圖6。從圖中可以看出，隨著Target濃度的增加，信號也跟著增加。當Target濃度在0.5 pM至1 nM范圍時，信號的增加與Target濃度的對數有比較好的線性關系，其回歸方程為Y(mM)=12.012+2.056logC(nM)，相關系數為0.995，檢測限為0.26 pM(S/N=3),Y代表血糖信號，C代表靶DNA的濃度。

圖6 檢測結果的線性相關曲線圖

5 結論

本實驗利用血糖儀建立了一種基于蔗糖酶修飾的納米金樹狀大分子對MRSA mecA基因檢測新方法。利用納米金樹狀大分子上可以結合更多酶性分子這一特點，實現了酶性放大。本方法檢測便攜、靈敏度高，擁有低的檢測限0.26 pM和寬的檢測范圍0.5 pM到1 nM。同時，我們提出的這種檢測策略，只需要改變捕獲核酸如適配體核酸，就可以實現其他生物分子的檢測。結果表明，該方法在疾病診斷方面具有潛在的應用價值。

[1]Bpharm W K, Jaruratanasirikul S, Pattharachayakul S, et al.Initial dosage regimen of vancomycin for septic shock patients:a pharmacokinetic study and Monte Carlo simulation.J Med Assoc Thai, 2014,97(11):1209-1219.

[2]Grundmann H, Aires-de-Sousa M, Boyce J, Tiemersma E. Emergence and resurgence of meticillin-resistant Staphylococcus aureus as a public-health threat, Lancet 2006,368:874-885.

[3]DeLeo F R, Otto M, Kreiswirth B N, Chambers H F, Community-associated meticillin-resistant Staphylococcus aureus, Lancet 2010,375:1557-1568.

[4]David M Z, Daum R S. Community-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus: epidemiology and clinical consequences of an emerging epidemic, Clin Microbiol Rev 2010,23: 616-687.

[5]Guk K, Keem J O, Hwang S G, et al. A facile, rapid and sensitive detection of MRSA using a CRISPR-mediated DNA FISH method, antibody-like dCas9/sgRNA complex. Biosensors and Bioelectronics, 2017,95: 67-71.

[6]Stamper P D, Cai M, Howard T, Speser S, Carroll K C. Clinical validation of the molecular BD GeneOhm StaphSR assay for direct detection of Staphylococcus aureus and methicillin-resistant Staphylococcus aureus in positive blood cultures. J Clin Microbiol, 2007,45: 2191-2196.

[7]Wang T, Zhang Z, Li Y, et al. Amplified electrochemical detection of mecA gene in methicillin-resistant Staphylococcus aureus based on target recycling amplification and isothermal strand-displacement polymerization reaction. Sensors and Actuators B: Chemical, 2015, 221: 148-154.

[8]Xiang Y, Lu Y. Using commercially available personal glucose meters for portable quantification of DNA. Analytical chemistry, 2012, 84(4): 1975-1980.

[9]Cao Y, Hao Y, Yang D, et al. Fluorescent PCR detection of mecA in drug resistant MRSA: a methodological study. British Journal of Biomedical Science, 2017,74(3): 152-155.

[10]Mathwig K, Albrecht T, Goluch E D, et al. Challenges of biomolecular detection at the nanoscale: nanopores and microelectrodes. Analytical chemistry, 2015, 87(11): 5470-5475.

[11]Esumi K, Akiyama S, Yoshimura T. Multilayer formation using oppositely charged gold-and silver-dendrimer nanocomposites. Langmuir, 2003, 19(18): 7679-7681.

[12]Qiu Z, Tang D, Shu J, et al. Enzyme-triggered formation of enzyme-tyramine concatamers on nanogold-functionalized dendrimer for impedimetric detection of Hg (II) with sensitivity enhancement. Biosensors and Bioelectronics, 2016, 75: 108-115.

[13]McLaughlin A C, Rogers W A, Fisk A D. Age-related glucometer design and selection: Tools and principles for optimal solutions. Diabetes technology & therapeutics, 2004, 6(3): 319-325.

[14]Xiang Y, Lu Y. Using personal glucose meters and functional DNA sensors to quantify a variety of analytical targets. Nature chemistry, 2011, 3(9): 697-703.

[15]Wang Q, Liu F, Yang X, et al. Sensitive point-of-care monitoring of cardiac biomarker myoglobin using aptamer and ubiquitous personal glucose meter. Biosensors and Bioelectronics, 2015, 64: 161-164.

[16]Qiu Z, Shu J, Jin G, et al. Invertase-labeling gold-dendrimer for in situ amplified detection mercury (II) with glucometer readout and thymine-Hg2+-thymine coordination chemistry. Biosensors and Bioelectronics, 2016, 77: 681-686.