超高效液相色譜-串聯質譜法同時檢測動物源性食品中殘留的35種β-受體激動劑和11種β-受體阻斷劑

(北京市食品安全監(jiān)控和風險評估中心，北京 100041)

β-受體激動劑類，又稱β-腎上腺素受體激動劑(β-adrenoceptor agonisit)，是一類可與β-腎上腺素受體結合，并形成刺激效應的藥物。β-受體激動劑通過選擇性的與細胞膜上的受體結合，發(fā)揮生理活性作用。在臨床醫(yī)療上，β-受體激動劑主要應用于通過擴張平滑肌治療由哮喘、阻塞性肺炎引起的支氣管痙攣。在畜牧業(yè)上，β-受體激動劑則被用作一種瘦肉增長劑。β-受體激動劑可使多種動物(豬、牛、羊等畜禽動物)體內營養(yǎng)成分由脂肪組織向肌肉組織轉移，這種作用稱為“再分配效應”，其結果是體內的脂肪分解代謝增強，蛋白質合成增加，能顯著增重并提高飼料轉化率，明顯改善肉質，具有誘人的經濟效益。這種再分配效應在上世紀80年代初由美國科學家發(fā)現，并推廣應用于畜牧養(yǎng)殖中，但是該類藥物會在動物體內造成嚴重的殘留，人食用了這類動物源性食品(特別是內臟)后，藥物殘留隨食物鏈進入人體，引起中毒反應，主要表現為肌肉震顫、口干、頭痛頭暈、心動過速、手抖，對于高血壓、心臟病患者危害更大，甚至危及生命。我國農業(yè)部連續(xù)出臺176號[1]、193號、235號、1519號公告，嚴令禁止包括“瘦肉精”克侖特羅在內的十余種β-受體激動劑在畜牧養(yǎng)殖中使用，并規(guī)定該類物質不得在動物源性食品中檢出。

β-受體阻斷劑(β-adrenoceptor blockers)與激動劑相似也是作用于β-受體，是能選擇性的與β-腎上腺素受體結合，從而拮抗神經傳遞質和兒茶酚胺對β-受體激動作用的一類物質。在臨床上，有抗高血壓、抗心肌缺血、通過抑制腎素釋放而發(fā)揮一定的阻斷腎素血管緊張素醛固酮系統(tǒng)作用、改善心臟功能和增加左心室射血分數、抗心律失常等。在過度使用的情況下，可減慢心率, ,嚴重心動過緩和房室傳導阻滯, 產生疲勞、頭痛、睡眠紊亂、失眠、多夢和壓抑等嚴重情況。雖然β-受體阻斷劑被廣泛用于動物運輸過程中防治由于動物應激而造成的突然死亡(通過降低心率，來延緩刺激)，但β-阻斷劑在動物源性食品中違禁使用的研究和報道幾乎沒有。由于這類藥物往往是在動物屠宰前的數小時內被注射使用的，因此該類藥物相對其他獸藥會造成更高的殘留量和更大的風險危害。長期攝入會造成焦慮、頭痛等精神癥狀，還有可能造成藥物依賴性。此類風險化合物目前的研究依然較少。另外β-受體激動劑和β-受體阻斷劑也都是國際奧林匹克委員會禁止使用的興奮劑類藥物。

目前, 國內外報道的動物源性食品中β-受體激動劑和β-受體阻斷劑的檢測的確證方法主要有氣相色譜-質譜聯用法(GC-MS)[2-6]、液相色譜-串聯質譜聯用法(LC-MS/MS)[ 7-13]等，基本上是單獨方法檢測，很難滿足對多種該類藥物殘留的同時檢測。本方法針對35種β-受體激動劑和11種β-受體阻斷劑建立了一種快速簡便、專屬性強、靈敏度高、檢出限低的超高效液相色譜-串聯質譜(UPLC-MS/MS)方法。

1 實驗部分

1.1 儀器

UPLC-TQS超高效液相色譜-串聯四極桿質譜聯用儀，美國Waters公司； Milli-Q純水儀，美國Millipore公司；3K15高速冷凍離心機，美國Sigma公司。

1.2 試劑

沙丁胺醇、特布他林、塞曼特羅(西馬特羅)、塞布特羅(西布特羅)、萊克多巴胺、克侖特羅、溴布特羅、苯氧丙酚胺、馬布特羅、馬賁特羅、溴代克侖特羅、菲諾特羅、氯丙那林、妥布特羅、噴布特羅、福莫特羅、異丙喘寧(奧西那林)、丙卡特羅、克侖塞羅、克侖丙羅(克侖普羅)、利妥特靈(利托君)、克侖潘特、異克侖潘特、苯乙醇胺A、齊帕特羅、班布特羅、沙美特羅、瑞普特羅、維蘭特羅、茚達特羅、阿福特羅、羥甲基克侖特羅、clenhexerol、吡布特羅、可爾特羅、拉貝洛爾、倍他洛爾、噴布洛爾、阿替洛爾、比索洛爾、阿羅洛爾、索他洛爾、納多洛爾、奈必洛爾、卡維他洛、美托洛爾、西馬特羅D7、克侖丙羅D7、萊克多巴胺D5、馬布特羅D9、馬賁特羅D11、沙丁胺醇D3、克侖特羅D9、沙丁胺醇D11、西布特羅D9、苯乙醇胺A-D3均購自德國Dr.Ehrenstofer GmbH公司；β-鹽酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶(100000Unit/mL)購自默克公司；乙酸銨購自Sigma-Aldrich公司。);固相萃取柱(Su-pelco Supel MIP beta-receptors25mg/10mL,Sigma-Aldrich 公司)；乙酸、高氯酸、氫氧化鈉、乙酸乙酯、叔丁基甲醚、氨水均為分析純;所用水為超純水。

1.3 混合標準工作液的配制

精密稱定適量的上述35種β-受體激動劑和11種β-受體阻斷劑對照品, 用甲醇配制成1000mg/L的標準儲備液，保存于-20℃冰箱內，有效期為半年。

1.4 樣品前處理

1.4.1樣品提取

豬肉及其制品粉碎，稱取粉碎均勻的樣品2.00g于50mL聚四氟乙烯離心管內，加入10ng內標標準物，加入10mL pH=5.20.2mol/L的乙酸銨-乙酸緩沖液，充分渦旋均質后，加入50μL β-鹽酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶，于37℃下200rpm震蕩酶解16小時。取出后冷卻至室溫，渦旋后于10000rpm下離心10min，取5mL上清液于一干凈的離心管中，加入5mL0.1mol/L高氯酸溶液，混合均勻后用高氯酸調節(jié)pH至1.0，渦旋后于10000rpm下離心10min，取出全部上清液至一干凈離心管中，用10mol/L氫氧化鈉溶液調節(jié)至pH為11.0，加入10mL飽和氯化鈉及10mL異丙醇/乙酸乙酯(5∶5)溶液，充分渦旋提取5min，于10000rpm下離心，取上層有機相清液在40℃下氮氣吹干。加入5mL 酶解用乙酸銨緩沖液，充分溶解殘渣后上柱。

1.4.2樣品凈化

取25mg10mL固相萃取柱用3mL甲醇，3mL水活化，溶解液全部上柱，控制流速在0.5滴/s，依次用3mL水，3mL60%的甲醇水溶液，1mL甲醇淋洗MIP柱，真空抽干后，用2mL含1%甲酸的甲醇溶液洗脫，控制流速在0.5滴/s，收集洗脫液于40℃下吹干，用1mL5%甲醇和95%5mmol/L乙酸銨0.1%甲酸水溶液溶解，過0.2μm聚四氟乙烯膜，供上機測定。

1.5 實驗條件

1.5.1色譜條件

液相色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18(100mm*2.1mm,1.7μm)；流動相：甲醇(A)和5mmol/L乙酸銨0.1%甲酸水溶液(B)，梯度洗脫條件如下表；流速：0.40mL/min；柱溫：40℃；進樣量：10μL(表1)。

表1 超高效液相色譜梯度洗脫條件

1.5.2 質譜條件

電噴霧離子源，正離子模式，毛細管電壓2.80kV，離子源溫度150℃，脫溶劑氣溫度400℃，脫溶劑氣流量800L/h，錐孔氣流量150L/h，霧化氣壓力7.0bar。碰撞氣流量0.17mL/min。46種化合物及的10種內標的質譜參數見表2，總離子流圖見圖1。

表2 β-受體激動劑和阻斷劑定量檢測質譜參數

續(xù)表2

續(xù)表2

續(xù)表2

圖1 β-受體激動劑和阻斷劑定量檢測總離子流圖

2 結果與討論

2.1 樣品前處理過程的優(yōu)化

2.1.1 萃取溶劑的選擇

多組分化合物的同步檢測要求樣品前處理方法必須能夠兼顧大部分目標化合物的回收率。在酶解之后，β-受體化合物游離于緩沖液之中，通過調節(jié)pH使環(huán)境呈酸性促進了化合物的電離平衡向離子化方向移動，更多的目標化合物以離子的形式存在于水相當中，而干擾物的蛋白質則由于等電點沉淀或進一步的酸解而沉淀下來，在冷凍離心的作用下，伴隨脂肪一起被除去。此時再將提取液調節(jié)至pH值呈堿性，使目標化合物的電離平衡向分子方向移動，目標化合物以不解離的分子狀態(tài)被不互溶的有機溶劑反萃取，水相中留下了pKa值不相同的其他可溶雜質。從提取初凈化的策略中可以看出，反萃取所使用的有機試劑的組成和配比是這一步驟中影響回收率的關鍵點。因此對萃取溶劑進行了優(yōu)化，主要考察了不同比例乙酸乙酯、異丙醇、乙腈的萃取效率。結果表明，乙腈相對于飽和鹽溶液具有互溶性，兩相分配不佳。46種化合物對乙酸乙酯和異丙醇的分配各異，采取不同配比時，所得到的萃取效率也各不相同。在兼顧所有化合物的原則下，最終確定使用乙酸乙酯∶異丙醇=5∶5進行萃取(圖2)。

圖2 不同萃取溶劑條件下46種β-受體激動劑和阻斷劑平均回收率情況

2.1.2 凈化條件的選擇

在多組分檢測方法建立的過程中要格外注意凈化步驟的選擇，首先要保證各化合物的回收率良好，在此前提下盡可能的除去雜質提高目標化合物的相應靈敏度。本項目在方法建立過程中研究對比了常用的幾種固相萃取凈化柱以及新型的分子印跡柱，具體選擇的對比型號如下：Waters Sep-pak C18 500mg/6mL，極性分配固相萃取；Waters Oasis HLB 150mg/6mL，親水親脂分配固相萃取；Waters Oasis MCX 150mg/6mL，混合強陽離子固相萃取；Dikma ProElut PXC 150mg/6mL，混合強陽離子固相萃取；Supelco Supel MIP beta-receptors 25mg/10mL，分子印跡固相萃取。實驗對比了以上5種凈化柱的凈化效率，以回收率作為凈化效果的參考，實驗結果表明，在C18柱上，多數化合物回收率小于70%，這可能是由于固相萃取柱柱效較低有關。在HLB柱上，由于依然是共價鍵結合分配機理，故回收率也不理想。MCX和PXC均為苯磺酸型強陽離子交換機理，國家標準中也多使用該類型的固相萃取柱，從實驗的結果看，能夠達到需要的凈化效果，但對于某些β-受體阻斷劑回收率不佳。MIP柱具備了特異性的β-受體結構，能夠特異性的結合β-受體激動劑和阻斷劑，這使得MIP柱凈化具有高度專一性和較好的回收率[14-20]。見圖3。

圖3 不同固相萃取柱凈化平均回收率情況

2.1.3 樣品基質效應的消除

基質效應是指當色譜分離時基質中存在的干擾物與待測目標化合物共洗脫從而改變了待測組分的離子化效率，所引起信號的提高或抑制。當基質效應影響較大時會降低方法的靈敏度，影響方法的準確性。本研究的樣品基質主要是動物肌肉、肝臟，基質成分比較復雜，基質效應明顯，因此為了最大限度消除基質效應干擾，本實驗采用基質加標法定量。在空白樣品基質中加入標準溶液系列進行相同的前處理步驟，得到基質加標標準曲線系列，可使標準溶液和樣品溶液具有相同的離子化環(huán)境，從而消除基質效應。同時采用內標矯正，更增加定量的準確度。

2.2 色譜-質譜條件的優(yōu)化

采用超高效液相色譜/串聯四極桿質譜對46種β-受體激動劑和阻斷劑進行定量檢測，由于這些化合物結構較為相似，化學性質差異不大，因此在色譜柱上的保留區(qū)別不大，更需要精細的條件將其分離，選用了waters ACQUITY UPLC BEH C18超高效液相色譜柱(100mm×2.1mm，1.7μm)。由于電噴霧質譜在電離時會有流動相組成中的各種離子存在，進而會影響分析物的離子化效率。對于反相C18柱，在流動相中加入低濃度的酸可以極大改善弱堿性化合物的峰型，同時加入低濃度緩沖鹽可以增加離子化效率，提高響應，因此選擇在水相流動相中加入5mmol/L乙酸銨以及0.1%的甲酸。

質譜條件的確定是使用IntelliStart軟件自動完成，對定量定性離子對、錐孔電壓、碰撞電壓均進行了優(yōu)化。為了減少質譜同一時間段采集離子的數目(會造成掃描時間過快，降低靈敏度)，根據化合物在液相色譜上保留時間的不同，對質譜方法進行了分段處理，以保證每個色譜峰均具有足夠的掃描次數，能夠完整的得到化合物的掃描數據。

2.3 定量檢測技術的方法驗證

2.3.1 標準曲線和檢出限

根據46種β-受體激動劑和阻斷劑基質加標標準曲線得到的數據，以峰面積-濃度繪制標準曲線。以得到信號為3倍信噪比的每種目標化合物的樣品濃度為準，即為該化合物的方法檢出限(表3)。

表3 β-受體激動劑和阻斷劑的標準曲線方程、相關系數、線性范圍和檢出限

續(xù)表3

2.3.2 方法的回收率和精密度

分別取動物肌肉、肝臟空白樣品，添加低、中、高3個不同濃度水平的46種β-受體激動劑和阻斷劑混合標準溶液，進行前處理，測定目標化合物。每個濃度水平進行6次試驗，結果見表4，46種化合物的平均回收率為62.31～110.52%，相對標準偏差為1.03～13.33%。

表4 β-受體激動劑和阻斷劑的回收率和相對標準偏差

續(xù)表4

續(xù)表4

3 結論

通過對方法檢測條件的優(yōu)化，建立了動物肌肉、肝臟中β-受體激動劑和阻斷劑的快速、高效前處理方法，結合超高效液相色譜/串聯四極桿質譜儀，實現了復雜樣品基質中46種β-受體激動劑和阻斷劑的高靈敏度、高特異性的定量檢測方法。該方法快速、靈敏、準確，穩(wěn)定，適用于食品安全突發(fā)事件的快速應急處置工作。

[1]農業(yè)部第176號公告. 禁止在飼料和動物飲水中使用的物質[S].

[2]朱堅,李波,方曉明,等.氣相色譜-質譜法測定肝、腎和肉中β2 -受體激動劑殘留量[J].質譜學報,2004,23(增刊)：245-247.

[3]孔瑩,邱月明,李鵬,沈建忠。固相萃取/氣相色譜-質譜同時測定豬肉中4種β-激動劑類藥物殘留量[J].分析測試學報，2006,25(2)：63-66.

[4]孟娟,邵兵,吳國華, 薛穎.氣相色譜-質譜法同時測定動物性食品中8種β-興奮劑的殘留量[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2005,15(6)：641-643.

[5]朱堅, 楊景賢, 李波, 等. 氣相色譜-質譜法測定肝、腎和肉中β-受體激動劑殘留量[J]. 分析測試學報, 2004, 23(9): 223-225.

[6]王培龍, 范理, 蘇曉鷗, 等. 分子印跡固相萃取-氣相色譜-質譜法測定豬尿中4 種伊受體激動劑[J]. 分析化學, 2012, 40(3): 470-473. .

[7]戴華,袁智能,黃志強,陳新煥。飼料中鹽酸克倫特羅、沙丁胺醇高效液相色譜測定[J].分析測試學報，2003,22(3)：57-59.

[8]韓婉清，吳楚森，吳玉鑾，等。超高效液相色譜-串聯質譜測定動物肌肉組織中32 種β-激動劑、β-阻滯劑和糖肽類抗生素藥物殘留[J].分析化學，2016,44(2)：289-296. DOI: 10。11895 /j.issn.0253-3820.150830.

[9]劉佳，謝云峰，任丹丹，等。反相液相色譜-串聯質譜法檢測豬肝中26 種β2 - 受體激動劑類藥物殘留[J].分析化學，2014,42(10)；1486-1492. DOI: 10.11895 /j. issn.0253-3820.140457.

[10] 張鴻偉,許輝,高建國,等。超快速液相色譜-四極桿/線性離子阱質譜同時檢測豬組織中9種β-受體阻斷劑殘留[J].色譜，2014,32(6)：573-581.

10.3724/SP.J.1123.2014.02014.

[11] Shao Bing, Jia Xiaofei, Zhang Jing, et al. Multi-residual analysis of 16β-agonists in pig liver, kidney and muscle by ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry[J]. Food Chemistry,2009, 114: 1115-1121.

[12] Carrasquilla M H. External contamination of bovine hair withβ-agonist compounds: 2 evaluation of decontamination strategies[J].Journal of Chromatography B, 2002, 767: 235-243.

[13]金雁, 姚家彪, 姜莉, 等. 高效液相色譜法同時測定禽肉中的克倫特羅和沙丁胺醇[J]. 現代儀器, 2005(5): 34-36.

[14]許輝,張鴻偉,張罡,王鳳美. 動物源食品中β受體阻斷劑殘留量測定的不確定度評定[J].質譜學報,2015,36(2):185-192. DOI:10.7538/zpxb.youxian.2014.0062.

[15]張毅, 岳振峰, 藍芳, 等. 分散固相萃取凈化與液相色譜/串聯質譜法測定牛奶中8 類禁用藥物殘留[J]. 分析化學, 2012, 40(5): 724-729.

[16] 宋迎春, 譚洪濤. 固相萃取及其在食品分析中的應用[J].江西醫(yī)學檢驗, 2005, 23(6): 583-585.

[17] Antignac J P, Marchand P, BIZEC B L, et al. Identification of ractopamine residues in tissue and urine samples at ultra-trace level using liquid chromatography-positive electrospray tandem mass spectrometry[J]. J Chromatogr B, 2002, 774(1): 59-66.

[18]孫雷,張驪,朱永林,王樹槐,等. 超高效液相色譜-串聯質譜法檢測動物源性食品中殘留的9種β-受體激動劑[J].色譜，2008,26(6)；709-713.

[19]吳平谷, 陳慧華, 王強, 等. 氣相色譜-質譜法測定動物組織中殘留的10種β-興奮劑[J]. 色譜, 2008, 26(1): 39-42.

[20]李俊鎖, 邱月明, 王超. 獸藥殘留分析[M]. 上海: 上海科學技術出版社, 2002: 365.