p-STAT3/5在肝癌中低表達機制的研究*

崔海鵬，張乘云，劉 凱，王愛國，趙 娟△

（1.承德醫學院，河北承德 067000；2.大連醫科大學）

目前，肝癌的發病機制尚不清楚，其發生發展伴隨著多種信號轉導機制參與[1]。STAT3/5（signal transducer and activator of transcription，STAT）作為信號傳導與轉錄活化因子，在癌癥的發生過程中發揮關鍵作用。有研究表明，STAT3/5信號通路的持續活化被視為癌癥發生的標志[1-3]；但Schneller等的研究發現，Ca-STAT3磷酸化可抑制癌癥的發生[4]。為進一步探討STAT3/5信號通路在肝癌發生過程中的作用機制，本研究利用H-ras 12V轉基因肝癌小鼠模型[5]，采用Western blot法檢測STAT3/5的活化水平，初步探討了STAT3/5信號通路在肝癌中的作用機制，以期為腫瘤的臨床研究提供一些依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和材料 SPF級雄性H-ras 12V轉基因小鼠10只，36周齡，體重25g～30g[大連醫科大學SPF實驗動物中心，生產許可證SCXK(遼)2015-0003，使用許可證SYXK(遼)2015-0006]。RIPA裂解液（P0013B）、Bradford蛋白濃度測定試劑盒（P0006）、超敏ECL化學發光試劑盒（Cat P0018）均購于碧云天生物技術有限公司，兔抗小鼠p-ERK、p-STAT3、p-STAT5均購于Cell Signaling公司，兔抗小鼠GAPDH抗體、HRP標記山羊抗兔二抗均購于Bioworlde公司。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集：取材前轉基因小鼠空腹過夜，分別取新鮮的肝癌組織和癌旁組織（腫瘤組織周圍未發生肝細胞癌的正常肝組織），迅速液氮冷凍保存，以備后續實驗。

1.2.2 Western blot檢測：RIPA裂解液提取組織樣本的總蛋白，Bradford蛋白濃度測定試劑盒進行蛋白定量。45μg蛋白于SDS-PAGE膠分離并轉膜，p-ERK（1：1000）、p-STAT3（1：1000）、p-STAT5（1：1000）、GAPDH（1：10000）兔抗小鼠一抗4℃孵育過夜。加入HRP標記山羊抗兔二抗(1：5000)，37℃孵育lh，洗膜后用超敏ECL化學發光試劑盒顯影。利用Quantity One 4.6.2光密度分析軟件對各蛋白目的條帶進行分析，以各目的條帶灰度值與GAPDH條帶灰度值的比值作為各蛋白的相對表達水平。

1.3 統計分析 采用SPSS 19.0統計學軟件進行數據分析。計量資料以（±s）表示，Shapiro-Wilk法檢驗數據符合正態分布，根據Levene方差齊性檢驗，兩組間差異比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

與癌旁組織相比，肝癌組織p-ERK蛋白表達顯著升高(P＜0.05)，p-STAT3、p-STAT5蛋白表達水平顯著降低(P＜0.05，P＜0.01)。見附圖、附表：

附圖 轉基因小鼠肝癌和癌旁組織p-ERK、p-STAT3、p-STAT5蛋白表達水平

附表 轉基因小鼠肝癌和癌旁組織p-ERK、p-STAT3、p-STAT5蛋白表達水平（±s）

附表 轉基因小鼠肝癌和癌旁組織p-ERK、p-STAT3、p-STAT5蛋白表達水平（±s）

與癌旁組織比較：*P＜0.05，#P＜0.01

組別 n p-ERK p-STAT3 p-STAT5癌旁組織 10 131.08±20.38 53.55±8.63 301.85±24.03肝癌組織 10 361.95±24.24* 6.48±1.53* 16.79±6.74#

3 討論

STAT3/5作為信號傳導與轉錄活化因子，可通過自身磷酸化進入到細胞核，參與細胞內信號通路的傳導。有研究證實，STAT3/5信號通路可促進細胞增殖、血管生成和細胞存活相關基因轉錄，并且STAT3/5信號通路持續性活化（磷酸化）被視為癌癥發生的標志[2-3]。同時，有研究表明，在人肝癌組織中，p-STAT3表達水平顯著升高[1]。趙振軍等[6]研究亦發現，人肝癌細胞株伴有STAT5的高表達。但本研究顯示，H-ras 12V轉基因小鼠肝癌組織p-STAT3、p-STAT5蛋白表達水平顯著低于癌旁組織，提示在H-ras 12V轉基因小鼠肝癌的發生過程中，STAT3/5信號通路被滅活，STAT3/5信號通路在肝癌發生中可能發揮抑癌作用，與Schneller等的研究結果一致[4]。因此，在不同癌癥的發生發展過程中，STAT3/5可能扮演不同角色。

H-ras 12V轉基因小鼠是采用轉基因技術建立的原發性肝癌疾病動物模型[5]，本研究發現其肝癌組織Ras下游p-ERK蛋白的表達水平顯著升高。另有研究發現，Ras/MEK/ERK信號通路可直接激活其下游多條信號通路，促進肝癌的發生、侵襲及轉移[7]。基于以上研究，推測在Ras癌基因誘導的肝癌發生過程中，可能是通過某條信號通路降低了STAT3/5的活化水平，但詳細分子機制有待進一步闡明。

綜上所述，本研究提示肝癌中p-STAT3/5蛋白的表達水平顯著降低，可為臨床肝癌的診斷提供新的實驗數據。

【參考文獻】

[1]王林，宋濤，王艷麗，等.p-STAT3在肝細胞肝癌中的表達及臨床意義[J].肝癌電子雜志，2014，(2)：40-43.

[2]Liu RY,Zeng Y,Lei Z,et al.JAK/STAT3 signaling is required for TGF-β-induced epithelial- mesenchymal transition in lung cancer cells[J].Int J Oncol,2014,44(5):1643-1651.

[3]Song C,Kim Y,Min GE,et al.Dihydrotestosterone enhances castration-resistant prostate cancer cell proliferation through STAT5 activation via glucocorticoid receptor pathway[J].Prostate, 2014,74(12):1240-1248.

[4]Schneller D,Machat G,Sousek A,et al.p199(ARF)/p14(ARF)controls oncogenic functions of signal transducer and activator of transcription 3 in hepatocellular carcinoma[J].Hepatology,2011, 54(1):164-172.

[5]崔海鵬，董建一，李慧玲，等.Ras/MAPK/ERK通過協同NF-κB促進肝癌細胞中cyclinD1的表達[J].實驗動物科學，2014，31(6)：1-6.

[6]趙振軍，張麗杰，鹿剛，等.STAT5在人肝癌細胞株SMMC-7721細胞內的表達[J].臨床檢驗雜志，2009，27 (3)：215-216.

[7]Li L,Zhao GD,Shi Z,et al.The Ras/Raf/MEK/ERK signaling pathway and its role in the occurrence and development of HCC[J].Oncol Lett,2016,12(5):3045-3050.