正交法優化野生牛肝菌多糖的提取工藝*

肖艷紅，周曉慧，徐 倩，王 冉，趙春穎

（承德醫學院，河北承德 067000）

真菌多糖具有多種生理活性，如抗腫瘤、抗氧化、提高免疫力等[1-3]。從真菌中提取并篩選有活性的多糖一直是國內外眾多領域研究和開發的熱點。牛肝菌[4]俗稱“大腳菇”，是一種稀有、名貴的野生食用真菌。根據文獻報道，牛肝菌多糖的提取方法較多。王浩華等[5]發現，微波法比水提醇沉法和超聲波法的提取率高，但工業生產上考慮綠色環保，不宜采用長時間、高強度的微波；李志洲[6]采用了泡沫分離法，但工藝中需要使用表面活性劑、消泡液等，增加了原料的消耗，且需要控制空氣流速，操作難度較大；杜敏華等[7]采用傳統的水提醇沉法，但并未全面考察各種因素對提取工藝的影響，多糖提取率較低。水提醇沉法為提取真菌多糖最經典的方法，具有工藝簡單、成本低、易于推廣等特點。為此，本研究使用了水提醇沉法，并采用正交試驗法優化了牛肝菌多糖的提取工藝，以期為進一步地開發利用牛肝菌提供實驗依據。

1 材料與儀器

牛肝菌，購于承德潤隆食品有限公司（批號20120906003）。所用試劑均為分析純。電熱恒溫水浴鍋（WSZ-133-65，上海東星建材實驗設備有限公司）；旋轉蒸發器（RE-52AA，上海亞榮生化儀器廠）；SHZ-D(Ⅲ)循環水式真空泵（石家莊陽星儀器貿易有限公司）。

2 方法與結果

2.1 牛肝菌多糖的提取流程[8]稱量牛肝菌粉末15.0g，加300ml石油醚于70℃水浴鍋中脫脂1.5h后抽濾。脫脂后的牛肝菌以不同的料水比于100℃水浴鍋中加熱不同時間，4000r/min離心10min。取沉淀重復加水、加熱、離心三個步驟，進行不同的次數。多次所得的上清液置于旋轉蒸發儀進行濃縮，濃縮比為5：1，向濃縮液中加入無水乙醇至不同的乙醇濃度。低溫靜置過夜后4000r/min離心10min，將上層酒精萃取液再次用旋轉蒸發儀進行濃縮、醇沉，4000r/min離心10min。收集兩次所得沉淀，即得牛肝菌多糖。牛肝菌多糖-40℃低溫冷凍48h干燥，稱量凍干膏，并計算多糖提取率。多糖提取率=（凍干膏質量/牛肝菌粉末質量）×100%。

2.2 牛肝菌多糖提取的單因素實驗 選用料水比、提取時間、提取次數和醇沉濃度4個因素進行單因素實驗，考察各因素變量對牛肝菌多糖提取率的影響，選出適宜的條件范圍。

2.2.1 料水比：多糖提取率隨料水比的增加逐漸增加，考慮濃縮過程的成本，初步確定料水比為1：20～1：30(g/ml)。見圖1：

圖1 料水比對多糖提取率的影響

2.2.2 提取時間：多糖提取率隨提取時間的延長而增加，但提取時間過長會增加能源消耗，故初步確定提取時間為1.0～2.0h。見圖2：

圖2 提取時間對多糖提取率的影響

2.2.3 提取次數：隨著提取次數的增加，多糖提取率逐漸上升。提取4次時最高峰值最高，因此確定提取2～4次進行正交實驗。見圖3：

圖3 提取次數對多糖提取率的影響

2.2.4 醇沉濃度：多糖提取率隨乙醇濃度的增大而增加，但乙醇濃度為85%時提取率下降，因此確定乙醇濃度為70%～80%。見圖4：

圖4 乙醇濃度對多糖提取率的影響

2.3 牛肝菌多糖提取的正交試驗設計 在單因素實驗結果的基礎上，以多糖提取率和多糖含量為考察指標，對料水比、提取時間、提取次數和醇沉濃度4個因素進行L9(34）正交優化。因素水平見表1：

表1 正交試驗因素水平表

2.4 牛肝菌多糖含量的測定 稱量凍干膏并加水溶解，結合葡萄糖標準曲線計算凍干膏中牛肝菌多糖含量。葡萄糖標準曲線的制作采用苯酚-硫酸法[9]。多糖含量=（多糖質量/凍干膏質量）×100%。

正交試驗結果見表2，方差分析結果見表3。影響多糖提取效果的因素順序為提取時間＞乙醇濃度＞料水比＞提取次數，其中提取時間對多糖提取效果的影響最顯著。確定最佳提取工藝為：A1B1C2D3，即料水比為1：20(g/ml)，提取2次，每次1.5h，乙醇濃度為80%。

表2 牛肝菌多糖提取正交試驗結果

表3 方差分析表

2.5 最佳提取工藝驗證 稱取牛肝菌粉末15.0g，共3份，分別按照最佳提取工藝進行平行驗證試驗。牛肝菌中多糖平均提取率為29.56%，干膏中多糖的平均含量為53.83%，菌體中多糖的平均含量為15.91%。表明本文中的最佳提取工藝合理，穩定可行，能有效提取牛肝菌中的多糖。結果見表4：

表4 優選工藝的驗證試驗

3 討論

本研究在實驗過程中發現，提取時間和次數達到最大時多糖已提取完全，繼續提取只會增加干膏中多糖以外其它成分的含量，因此隨著提取時間的延長和提取次數的增加，干膏中多糖含量與多糖提取率并不成正比。本研究通過正交試驗，以多糖提取率和干膏中多糖含量為評價指標，篩選出了牛肝菌多糖的最佳提取工藝，即料水比1：20(g/ml)、提取2次、每次1.5h、醇沉時乙醇濃度為80%。此時牛肝菌多糖提取率為29.56%，干膏中多糖含量高達53.83%，菌體中多糖含量為15.91%。

【參考文獻】

[1]Jia J, Zhang X, Hu YS, et al. Evaluation of in vivo antioxidant activities of Ganoderma lucidum polysaccharides in STZ-diabetic rats [J]. Food chemistry, 2009, 115(1): 32-36.

[2]Meng F, Liu X, Jia L. Optimization for the production of exopolysaccharides from Morchella esculenta SO-02 in submerged culture and its antioxidant activities in vitro [J].Carbohydrate Polymers, 2010, 79(3):700-704.

[3]盛偉，方曉陽，吳萍.白靈菇、杏鮑菇、阿魏菇多糖體外抗氧化活性研究[J].食品工業科技，2008，29(5)：103-106.

[4]崔福順，張華，李官浩，等.美味牛肝菌黃酮類提取物體內抗氧化作用研究[J].食品科技，2014，39(8)：201-205.

[5]王浩華，謝美華，宋信信.云南野生粗網柄牛肝菌粗多糖提取工藝及抗氧化能力的研究[J].楚雄師范學院學報，2015，30(9)：44-47.

[6]李志洲.泡沫分離法優化美味牛肝菌多糖分離工藝[J].食品與機械，2012，28(3)：130-134.

[7]杜敏華，張英君，劉明星，等.野生牛肝菌多糖提取工藝的優化及其對自由基的清除作用[J].食品工業科技，2012，33(22)：292-295.

[8]熊偉，陳芝蘭，鐘國輝，等.西藏野生變色疣柄牛肝菌粗多糖提取及單糖組成研究[J].應用化工，2007，36(6)：554-556.

[9]涂宗財，李敏，劉光憲，等.苯酚-硫酸法測定油菜花粉多糖含量的研究[J].食品工業科技，2007，28(4)：219-221.