柞蠶核型多角體病主要防治技術概述＊

呂 銀，程 明，柯皓天，劉 玲，陳祥平，范小敏

（1.四川省絲綢科學研究院，四川 成都 610031；2.四川省絲綢工程技術研究中心，四川 成都 610031；3.四川省絲綢協會，四川 成都 610031）

柞蠶（Antheraea pernyi）屬昆蟲綱、鱗翅目、大蠶蛾科、柞蠶屬的吐絲昆蟲，我國柞蠶、柞樹資源豐富，柞蠶鮮繭產量約占全世界總產量的90%以上，經濟價值大。柞蠶核型多角體病又稱柞蠶膿病，是柞蠶生產的主要病害之一，由于各地發病時期和癥狀不盡相同，也稱嫩起子、水眠子、半蛻皮、老虎蠶、黃爛皮、油爛繭以及里倒山等。該病發生廣泛，我國遼寧、吉林、黑龍江、河南、山東、四川等柞蠶產區及國外飼養柞蠶區都有發生，一般年份的發病在10%左右，嚴重時達50%以上，危害嚴重。一直來對柞蠶核型多角體病主要從改善放養環境和養蠶技術上加以防治，上世紀60年代后，科技工作者開始從傳染途徑、發病機理和消毒措施等方面進行綜合防治研究。

李光澤等研究ApNPV感染潛隱期，發現蟻蠶感染多角體病毒，主要在1齡、2齡發病；蟻蠶食下經藥劑或自然致弱的多角體病毒后，潛伏期顯著延長，到4齡、5齡開始發病；將游離病毒接種蛹體，病毒增殖可分四個時期：減少期、潛隱期、高速增殖期和平穩期，25℃下潛隱期為8 d，但經0.5%福爾馬林致弱處理，其潛隱期延長為17 d。

李光澤等研究柞蠶消化液對多角體病毒的滅活作用，發現柞蠶消化液是ApNPV感染的主要防御物質，游離態病毒在消化液中10 min便失去活性，多角體病毒在消化液中120 min失去活性，其消化液的滅活力隨柞蠶齡期的增進而逐漸提高；柞蠶經0～5℃低溫處理48 h后，消化液對病毒的滅活力明顯降低，如處理后移至常溫下，則消化液的滅活力逐漸恢復，24 h后基本恢復；起蠶經40℃以上高溫處理4 h，消化液的滅活力也顯著降低，盛食期影響較小；蠶大量喝水也能降低消化液對病毒的滅活力；消化液中某種物質對病毒的滅活起主要作用，消化液離體于60℃以上高溫下處理1 h則這種物質完全失去活性，于室溫下放置24 h則其活性明顯降低，但低溫（-35℃）處理對其活性影響不大。柞蠶核型多角體病的傳染途徑主要為經口食下傳染和體壁創傷染，切斷其傳染途徑是預防該病發生的關鍵。給柞蠶體接種福爾馬林死毒疫苗，因為柞蠶體本身沒有完整有免疫系統，其保護指數在0.5以下，此防治技術無應用價值；先后篩選上百種抗病毒藥劑，僅有肽丁胺等少數幾種有一定的治療效果，但治愈率只有30%左右，所以藥物治療也不實用；根據病原特性及傳染機制，采用消毒防病的措施，取得了很好防治效果。

隨著新技術和抗病品種的推廣應用，柞蠶核型多角體病的發病率基本控制在10%以下，但近幾年來，四川蠶區柞蠶核型多角體病又出現起伏，甚至有上升的趨勢。

1 柞蠶核型多角體病毒特征及傳染途徑

柞蠶核型多角體病的病原為桿狀病毒科（Baculovirudae）、核型多角體病毒屬（Alphabaculovirus）的柞蠶核型多角體病毒（Antheraea pernyi Nuclear Polyhedrosis Virus，ApNPV）。ApNPV有兩種存在形式，一種是多角體病毒，病毒粒子包埋在多角體中，另一種是游離態病毒，沒有多角體包被的裸露病毒。

1.1 多角體病毒

多角體在光學顯微鏡下呈三角形、四角形或不規則形，具有較強的折光性和淡青色熒光；在電子顯微鏡下大多呈為三角形四面體、四角形六面體及不規則體。多角體的蛋白晶格具有高度規則性，排列均一、整齊。多角體大小因宿主齡期和組織的不同存在差異，在0.7 μm～10 μm間。1～2齡蠶體內形成的多角體較小，4～5齡蠶體內形成的多角體較大。同一組織不同細胞內形成的多角體大小也存在差異，但同一細胞內多角體的大小基本一致，一個細胞內多角體數量越多則多角體就越小，反之亦然。成熟多角體的表面多光滑致密，不成熟多角體的表面多凹凸不平，處在裂解期多角體的表面呈縱橫飾紋或瓦棱狀。多角體本身不具備致病能力，但包埋內的病毒可借助其保護而長時間保持致病能力。

1.2 游離態病毒

游離態病毒體積小，只有在電子顯微鏡下才能看到，所以游離態病毒能通過細菌濾過器，因此也稱濾過性病毒。ApNPV粒子多呈桿狀，大小約為55 μm×350 μm，紫外檢測屬典型的昆蟲桿狀病毒。成熟的ApNPV粒子被雙層膜包裹，發育膜在最外層，內膜為緊貼病毒體和發育膜的一層薄膜，封堵在多角體內的的ApNPV粒子常常形成整齊排列的病毒束。自然狀態下病毒粒子可經口或通過體壁創傷口引起感染，ApNPV感染組織細胞時，便釋放出核酸而留下外殼，核酸為雙鏈環狀脫氧核糖核酸，約130 kb，可復制、增殖，具有感染性，蛋白質外殼不具有致病能力。病毒粒子的其中一端有一個吸附裝置的突起，在病毒侵染時發揮作用。當柞蠶感染ApNPV后，在細胞核內形成一種特異的產物即多角體，在多角體內包埋許多具有致病能力的病毒粒子。

1.3 傳染途徑

柞蠶核型多角體病是一種急性傳染病，多角體病毒和游離病毒都能經食下傳染和創傷傳染引起該病的發生，而游離病毒只能經創傷傳染引起該病的發生。ApNPV附著在柞蠶卵面或新鮮柞葉上，隨蟻蠶孵化或者幼蟲食葉而進入蠶中腸，堿性消化液將多角體溶解后釋放出病毒粒子；一部分病毒粒子脫去囊膜和核衣殼后進入中腸細胞，核酸在細胞核內進行復制，但只有少數會形成多角體態病毒，另外部分病毒粒子進入體腔后隨血液循環而侵入脂肪體、血細胞、氣管上皮細胞、體壁真皮細胞等，在細胞核內復制、增殖，形成多角體；隨著不斷的增值，細胞核也不斷變大，直到整個細胞核充滿了多角體，細胞核乃至整個細胞被多角體撐破；以上就是食下傳染，是該病的主要傳染途徑。此外，因在收蟻和養蠶過程中的勻蠶、移蠶等操作不當，造成幼蟲體壁創傷，也能引起游離病毒的創傷傳染而發病。

王林美等研究ApNPV對柞蠶蛹卵巢細胞的感染性，發現在倒置顯微鏡下，柞蠶蛹卵巢細胞被Ap-NPV感染5 d后，細胞內開始有多角體病毒出現，細胞開始變得脹大，被感染7 d后，多角體數量顯著增多，此時培養細胞的上清液中檢測到包涵體病毒效價濃度為6.95×105TCID50/mL；在電子顯微鏡下，細胞早期的表現為細胞核逐漸膨大，隨后在細胞核內檢測到核衣殼和病毒發生基質，然后形成病毒束，成為成熟的病毒粒子，一個多角體中包埋有多個病毒粒子，多角體具有強折光性，直徑在0.7 μm～10 μm；ApNPV對柞蠶蛹卵巢細胞敏感度較高，為典型的桿狀病毒復制。

2 柞蠶核型多角體病的發病癥狀

柞蠶核型多角體病主要發生在蠶期和蛹期，其典型癥狀是：蠶體腫脹，體皮變色并質脆易破，化膿腐爛。由于蠶的發育時期不同，病蠶表現出來的癥狀也有明顯差異。

2.1 幼蟲期病癥

柞蠶核型多角體病在1齡期發病較少，多發生在2齡、3齡眠中或眠起時，俗稱“水眠子”，表現為病蠶體壁柔軟、體節腫脹、體色變黃、體腔內血淋巴增多，通常用腹足及尾足抱住柞樹枝條，頭部下垂，隨著病勢發展，體壁逐漸潰爛，流膿而死。指蠶染病后，在眠起蛻皮時舊皮脫下一部分，有的僅蛻下一半舊表皮，呈半蛻皮蠶，多倒掛于柞樹枝葉而死，表現為“半蛻皮”。“嫩起子”指病蠶眠起蛻皮后，體壁柔軟不硬化，體色暗淡，體節腫脹，有時尾部的三角板變成黑褐色，隨著病情發展，體壁逐漸破裂，流膿而死。“黃爛皮”多發生在3～5齡，病蠶初期體色變淡，皮下、脂肪體等組織開始潰爛，混濁呈豆腐腦狀，隨著病勢加重，體壁逐漸破裂、流膿而死。“老虎蠶”多發生在5齡盛食期至營繭前，病蠶初期體節腫脹，背部疣狀突起和氣門線下疣狀突起部位可見褐色、灰色的小斑點，由小變大，形成黑褐色病斑，形如虎皮斑紋，故稱老虎蠶，隨著病勢加重，病斑處逐漸破裂，流膿而死。“油爛繭”指一部分患病較輕的蠶可吐絲結繭，有的蠶只吐出一部分絲，死于繭殼內，尸體逐漸潰爛，流出膿汁污染繭殼呈黑褐色，也稱“里倒山”。

2.2 蛹期病癥

柞蠶在4齡、5齡感染ApNPV，可能延遲至蛹期發病，病蛹癥狀為：體色渾暗，蛹皮脆弱，顱頂板變成黑灰色或灰褐色，稍經觸動即破裂而流出膿汁，流出的膿汁浸透繭殼，成為油爛繭狀。有的病蛹、膿汁在繭殼內慢慢陰干，整個繭變得很輕，而稱為“空瓤繭”。

3 防治措施

柞蠶核型多角體病屬強烈的傳染性疾病，必須從阻斷傳染途徑、增強蠶抵抗力以及改善放養條件等多方面綜合施策，才能取得良好的防治效果。朱有敏等研究柞蠶對ApNPV感染的抵抗性與部分生命力性狀的相關性，發現孵化率與稚蠶對ApNPV感染的抵抗力呈顯著正相關，其相關系數為0.71，而與5齡壯蠶對ApNPV感染的抵抗力及自然發病率相關關系不顯著；5齡壯蠶對ApNPV感染的抵抗性與5齡壯蠶感染ApNPV后的蟲蛹統一生命率相關系數為0.98，呈顯著正相關；柞蠶品種對ApNPV的抗性，應依據稚蠶期和5齡壯蠶期2個發育階段對病毒感染的抵抗性來進行綜合鑒定。

賈姝等分析ApNPV侵染對柞蠶幼蟲體內部分保護酶活性的影響，發現柞蠶幼蟲被ApNPV侵染后，其血淋巴中的超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）活性逐漸升高，分別在接種后第3天、第4天達到最大值，分別是573.97 U/（mL·min）、0.11 U/（mL·min），之后又逐漸下降；血淋巴中的過氧化氫酶（CAT）活性則表現出先降低后升高的變化趨勢，接種后第5天達到峰值378.44 U/（mL·min），之后又逐漸下降；在柞蠶對ApNPV的免疫防御過程中，POD、SOD首先作出應答反應，CAT其后作出應答反應，且試驗組幼蟲血淋巴中的POD活性始終高于發育同期的對照組幼蟲，推測POD是起主要作用的保護酶。

3.1 消滅病毒，切斷傳染途徑

柞蠶核型多角體病發生的主要原因為病毒感染，其中卵面感染和1齡、2齡小蠶期感染最為重要。因此，嚴格消毒，徹底消滅病毒，是預防該病發生的關鍵。蠶室、蠶具用3%甲醛溶液噴霧消毒或毒消散（5 g/m3）熏蒸消毒，密封24 h后通風，周圍環境及走廊通道用5%石灰水噴灑或生石灰粉消毒。蠶具也可單獨用石灰水浸泡或用甲醛與高錳酸鉀作用產生的氣體消毒。卵面消毒在春季一般先用0.5%～0.8%氫氧化鈉洗卵1 min，然后再用10%鹽酸浸卵10 min，或者用3%甲醛（鹽酸甲醛混合液）浸泡30 min（24±1℃）；在秋季直接用3%甲醛（鹽酸甲醛混合液）浸泡30 min（24±1℃），或用甲醛與高錳酸鉀（100 mL：60 g）混合產生的甲醛氣體消毒60 min；為了防止卵面消毒后的再感染，消毒后的蠶卵應及時送到山上蠶場或保存在無毒保卵室內陰干，進入保卵室的人員要防止帶入病毒，沒有條件建立保卵室的，可直接放入保卵盒，或放在無污染、未堆過繭、未制過種的潔凈房屋保卵。

3.2 及時收蟻，防治抓傷傳染

小蠶相互抓傷而發生創傷傳染是柞蠶核型多角體病發生的主要原因之一。春蠶期多在室內暖卵，一般黎明時孵化，很難做到及時收蟻。為了改變這種狀況，可以在孵化前一天晚上，將卵拿至室外，24 h左右再拿回室內，這樣孵化時間將推遲到早上7時左右，邊出蠶邊收蟻，可以避免小蠶成堆，互相抓傷，每天重復，直至全部孵化。秋蠶期孵化時溫度較高，更要掌握好孵化時間，同時嚴格消毒，按時收蟻，及時上山。

3.3 加強養蠶管理，防止蠶期擴大傳染

科學養蠶，及時勻蠶、移蠶，使蠶良葉飽食。選用上年未發病或發病較輕的柞園飼養春蠶。蠶期嚴禁摟草，防止塵土污染，避免雨天、大霧天或中午溫度較高時移蠶，小蠶期抵抗外界惡劣環境能力較差，可采取適當的保護措施。發現病蠶及時淘汰，集中深埋或燒毀；防止病蠶污染柞葉、蠶具、人體以擴大傳染。夏季應避免雨天摘繭，需適時摘繭、隨摘隨剝、及時穿掛，避免種繭堆放，發現油爛繭及時挑出并銷毀或深埋。應加強種繭、種卵保護，保持適當的溫濕度。

3.4 推廣抗病品種及雜交種

提高柞蠶對核型多角體病毒的抵抗能力以及選育高抗品種，是防治柞蠶核型多角體病的有效措施之一。選擇抗病性強和上代放養精細、發育健壯、發病較輕的蠶種進行放養，生產上推廣應用抗病品種和雜交種，可一定程度減少發病，提高產量、增加收益。

4 柞蠶核型多角體病的分子生物學研究

柞蠶屬野外放養的泌絲昆蟲，具有蛹體較大、以蛹越冬、方便保存、容易固定、保存時間長且便于運輸等特性。利用柞蠶蛹作為生物反應器生產功能性蛋白質，既能大規模機械化生產，又能有效降低勞動強度以及減少操作上的煩瑣。黃元姣等用ApNPV載體表達系統，將BO半乳糖苷酶基因（LacZ）在柞蠶培養細胞（AnPe細胞）中實現成功表達，同時通過進行篩選、純化，獲得了AnpeLacZ重組病毒。賈平驁等利用BLAST軟件在線檢索ApNPV特異基因ORF142的序列后，設計了引物AP1，對ApNPV基因組DNA進行了PCR擴增，獲得大約130 bp的DNA片段，其病毒DNA最低檢測濃度為0.5 fg/mL，用該方法檢測ApNPV快速而方便，且添毒濃度與感染后的檢出時間呈正相關。

病毒microRNAs（VmiRNA）是病毒基因組編碼的一種小RNA分子，在病毒侵染宿主以及病毒繁殖過程中發揮作用。李文利等采用現代分子測序技術檢測柞蠶被ApNPV感染后的病毒microRNAs含量變化，并用計算機分析技術預測ApNPV基因編碼的VmiRNA前體序列，結果從被ApNPV感染的柞蠶蛹脂肪體中擴增出13條預測前體序列，且在病毒基因組中可以找到10條同源序列；利用熒光定量PCR技術證明有9條同源序列能夠擴增出相應大小的基因片段，初步確認這是由病毒基因組編碼的VmiRNA成熟序列；利用靶基因在線預測程序RNAhybrid預測，獲得這些VmiRNA作用的135個可能的靶向基因，其中36個基因與免疫應答過程相關，19個基因與免疫系統進程相關，8個基因與免疫調節相關，9個基因與免疫系統發育相關，推測這些VmiRNA在病毒與宿主的相互作用中發揮著重要作用。

為探究ApNPV載體表達系統是否可用于表達哺乳動物活性蛋白，葉博等利用該表達系統表達醫用蛋白人生長激素（hGH），發現柞蠶蛹感染重組病毒后7 d，體液中明顯檢測到hGH表達；之后hGH含量保持較高水平，重組hGH的最高表達量達到251.18 μg/mL；第15～20 d仍可檢測到hGH表達，但表達產物開始降解；利用活化的人白血病細胞K562檢測經ApNPV載體表達系統在蠶蛹內表達的重組hGH的體外活性，顯示重組hGH對細胞K562的增殖具有顯著的促進作用。為了探索ApNPV內源性非編碼小RNA成熟體MD5對宿主靶基因的功能，宋麗新等利用現代生物信息學以及Solexa高通量測序技術，從ApNPV基因組中篩選、分離出成熟的MD5，通過GO數據庫分析MD5對靶基因的功能，發現MD5調控的宿主靶基因在細胞內的分子結合、免疫反應以及酶催化中發揮作用，其中有4個靶基因與柞蠶免疫應答相關；熒光定量PCR檢測MD5在脂肪體內表達上調，推測VmiRNA MD5在宿主柞蠶免疫相關基因的表達過程中扮演著重要角色。