HPLC法測定新面醑中甲硝唑、氯霉素、水楊酸含量

劉 徽，蔡 琳，廖海燕

新面醑為第三軍醫大學第二附屬醫院生產的醫院制劑，臨床主要用于治療尋常痤瘡及頭皮脂溢性皮炎等，為常見的皮膚科用藥。其主要有效成分為甲硝唑、氯霉素、水楊酸，原《總后衛生部非標準制劑標準》采用容量分析方法測定水楊酸的含量，卻未對甲硝唑和氯霉素含量做具體規定。為了實現對該制劑質量的更好監控，通過查閱相關文獻資料[1-6]，對甲硝唑和氯霉素含量測定方法，采用高效液相色譜（HPLC）法居多，筆者探討了采用HPLC法同時檢測甲硝唑、氯霉素、水楊酸含量的方法，供同仁參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀（島津，日本），優普系列超純水器（型號：UPT-Ⅰ，生產廠家：成都超純科技有限公司），超聲波清洗器（型號：KQ5200E，生產廠家：昆山市超聲儀器有限公司），電子分析天平（型號：BT25S，生產廠家：賽多利斯）。

1.2 試藥 甲硝唑對照品（中國食品藥品檢定研究院，純度 99.9%，批號：100191-201507），氯霉素對照品（中國藥品生物制品檢定所，純度99.4%，批號：130555-201203），水楊酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，100106-201104，純度：99.9%），甲醇（成都科龍化工試劑廠，批號：2013120401），磷酸（成都科龍化工試劑廠：批號：20130413），色譜甲醇（A455-4，飛世爾，美國），超純水（自制），新面醑（第三軍醫大學第二附屬醫院生產，批號：170207、170219、170316）。

2 方法與結果

2.1 溶液制備

2.1.1 對照品溶液制備 取甲硝唑、氯霉素、水楊酸對照品適量，加流動相制成每1 ml分別含甲硝唑0.1mg、氯霉素0.1mg、水楊酸0.0125mg的溶液，混合后作為對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液制備 取新面醑2ml，置200ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，過濾，取續濾液作為供試品溶液。

2.1.3 陰性對照溶液 按照處方，分別加入除甲硝唑、氯霉素和水楊酸以外的其他成分，制備陰性樣品100ml，按照“2.1.2”制備方法制成陰性對照溶液。

2.2 色譜條件 色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱 Inertsustain C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇 -水（55∶45）（pH3.2），檢測波長 230 nm；柱溫 35℃，進樣量：10 μl。

2.3 方法學考察

2.3.1 專屬性實驗 按照上述色譜條件進樣對照品溶液、供試品溶液及陰性對照品溶液各10μl，3組分出峰順序依次為甲硝唑、氯霉素、水楊酸（圖1）。3組分保留時間分別為4.4、7.0、10.0min，分離度分別為1.8、3.2、3.9，分離度均符合規定。結果顯示陰性對照溶液在主峰位置無色譜峰，專屬性良好。

2.3.2 線性關系考察 采用上述方法分別進樣對照品溶液各 2、4、8、10、12、20 μl，記錄色譜圖。 以峰面積（A）對進樣濃度 C（μg/ml）進行線性回歸，得甲硝唑線性方程為：A=14956C+5142（n=6），r=0.9999；氯霉素線性方程為：A=10343C+3288.5（n=6），r=1；水楊酸線性回歸方程為：A=36578C-845.65（n=6），r=1。結果表明：甲硝唑、氯霉素、水楊酸分別在21.78～217.78 μg/ml、20.48～204.76 μg/ml、5.01～50.15 μg/ml范圍內，與峰面積呈現良好的線性關系。

2.3.3 精密度實驗 取“2.1.1”項下對照品溶液，按照上述色譜條件依次連續進樣5次，記錄色譜圖，計算各組分峰面積的RSD，結果分別為0.4%（n=5）、0.6%（n=5）、0.7%（n=5），表明該方法精密度實驗良好。

2.3.4 重現性實驗 取批號為170207供試品2ml，精密量取，分別置6個 200 ml量瓶中，按“2.1.2”處理制成供試品溶液，按照上述色譜條件依次進樣，記錄色譜圖，計算3組分峰面積RSD分別為0.5%（n=6）、0.7%（n=6）、0.8%（n=6）， 表明方法重現性實驗良好。

2.3.5 重復性實驗 取批號為170207供試品2ml，照“2.1.2”處理得供試品溶液，室溫下存放，依次在同一天內第 0、2、4、8、12、16、20、24 h 進樣分析，分別記錄3組分峰面積，計算3組分含量RSD分別為 0.6%（n=8）、0.7%（n=8）、0.9%（n=8），結果表明供試品溶液中3組分在24 h內穩定。

2.3.6 加樣回收率實驗 精密吸取批號為170207供試品1 ml（含甲硝唑、氯霉素、水楊酸分別為：10.02 mg/ml、10.04 mg/ml、2.52 mg/ml）各 9 份，分別置9個200ml量瓶中，再精密稱取甲硝唑、氯霉素、水楊酸對照品適量，分別按已測出供試品含量的80%、100%、120%各 3份投于上述量瓶中，按“2.1.2”方法制備成供試品溶液，按上述色譜條件分別進樣10μl，記錄3組分峰面積和各對照品加入量，計算各組分平均回收率及相對標準平均偏差，結果見表1。

2.4 樣品含量測定 取甲硝唑、氯霉素、水楊酸對照品適量，精密稱定；取3個批號的新面醑為樣品，按照“2.1.1”和“2.1.2”項下制成對照品溶液和供試品溶液，對照品溶液平行制備2份，供試品每批次平行制備3份，按照上述色譜條件依次進樣，記錄3組分峰面積，按外標法計算3組分含量，求平均含量和相對標準平均偏差（RSD）。 結果見表2。

表1 新面醑中甲硝唑、氯霉素、水楊酸回收率結果(n=9)

表2 新面醑中甲硝唑、氯霉素、水楊酸含量測定結果及RSD(mg/mI）

3 討論

檢測波長的確定：本研究采用SPD-M20A二極管陣列檢測器，通過對3組分進行全波長掃描檢測，水楊酸在230 nm處的吸光度最高，甲硝唑和氯霉素在此波長也存在吸收，且根據處方得知，水楊酸處方量較少，故采用230 nm作為3組分的共同檢測波長。

圖1 高效液相色譜圖

原標準在對該品種進行質量控制時，只是采用容量分析方法對水楊酸進行含量測定，顯然已不能滿足最新藥典的要求，為了患者用藥安全，本研究建立HPLC法對該品種3組分進行全面質量控制，探索通過一種色譜條件同時測定該品種中3組分含量的方法。通過對方法的精密度、重復性、回收率等參數進行研究，結果表明，HPLC法測定本品時的精密度、重復性、回收率均良好，故該分析方法可以作為同時測定新面醑中3個主要成分含量的測定方法，為建立質量標準提供參考依據。

[1] 張玉英，劉俊東.紫外分光光度法測定氯霉素水楊酸酊中氯霉素和水楊酸濃度[J].山東醫藥，2008，48（16）：46.

[2] 宋建建.高效液相色譜法測定復方甲硝唑擦劑中成分含量分析[J].中國中醫藥咨訊,2011,3（6）：310.

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[5] 王菊花，李容．系數倍率法測定復方氯霉素酊中兩組分的含量[J]．心理醫生,2011,6：222．

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