穿膜肽標記的熒光素酶蛋白在大腸桿菌中表達條件的優化及其活性研究

余婷玉,方志遠,黃 衛,王淋荊,徐 寧

(1.廣州中醫藥大學 第二臨床醫學院,廣東 廣州 510405；2.中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院,廣東 廣州 510530；3.廣州中醫藥大學 廣東省中醫院檢驗醫學部,廣東 廣州 510370)

熒光素酶(luciferase,LUC)是用于測定腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)的靈敏、可靠的生物傳感器[1]。在有氧的條件下,ATP參與熒光素酶催化熒光素釋放熒光過程,并且釋放的熒光強度與ATP含量呈正相關。對于細胞內的ATP檢測,必不可少的細胞裂解后ATP提取過程會導致部分ATP水解[2],不利于高通量的藥物篩選。

因此為了快速精確檢測細胞內ATP的含量,本實驗研發了一種由穿膜肽和熒光素酶組成的嵌合蛋白(TAT-Luciferase,TAT-LUC)。細胞穿膜肽(cell penetrating peptides,CPPs)特指那些小于20個氨基酸、帶正電荷的短肽,可以穿過大多數細胞膜。它們可以將多種生物活性物質攜帶入細胞中而無需特殊的培養環境,包括小分子化合物、染料、多肽、蛋白質、質粒、脂質體、病毒等[3-7]。其中研究較多的是1988年發現由人類免疫缺陷病毒-1型(HIV-1)基因編碼的一種被稱為反式轉錄激活因子(transactivator of transcription,TAT)的蛋白[8]。Fawell等[9]進一步研究發現,與TAT共價結合的異源蛋白可被其轉移到細胞內。本研究則利用TAT-LUC使熒光素酶在TAT的輔助下進入細胞,可在不用裂解細胞的條件下對活細胞內ATP濃度進行實時檢測。

為了得到大量有活性的TAT-LUC蛋白，可以采用比真核表達系統更為簡單的大腸桿菌生產制備。其中影響蛋白原核表達的影響因素很多,包括宿主菌、表達載體、誘導表達時機、溫度和誘導劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)濃度等。因此研究的重點是對該重組蛋白TAT-LUC的誘導時機、誘導表達溫度和IPTG濃度等因素進行優化,以提高重組大腸桿菌周質中可溶性TAT-LUC的表達量,并且將得到的TAT-LUC 與LUC進行對比檢測ATP,通過發光強度檢測分析TAT-LUC的敏感性和可靠性,為后期大規模的表達、純化和應用奠定基礎。

1 材料

含穿膜肽標記的熒光素酶基因的重組質粒pET28a-TAT-LUC由本實驗室構建保藏，并成功轉化BL21 (DE3)感受態細胞。LB培養基(含50 μg/mL卡那霉素),IPTG(廣州杰特偉生物科技有限公司),D-蟲熒光素鈉鹽(阿拉丁,上海),熒光素酶(Promega,美國),ATP(ATP二鈉鹽,Sigma),RPMI1640培養基(Hyclone,美國),雙抗(Hyclone,美國),胰酶(Gibco,美國),胎牛血清(四季青,中國),磷酸鹽緩沖液(PBS,Sigma,上海)。

2 方法

2.1 誘導表達條件的優化

將轉化成功的轉化菌培養過夜后,按照1∶100比例接種于3 mL含卡那霉素的LB液體培養基中,37 ℃下210 r/min振蕩培養。首先,在37 ℃條件下培養,當菌液OD600分別達到0.15、0.4、0.6、0.9、1.4、2時加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG;接著在22 ℃下繼續誘導表達16 h以確定表達TAT-LUC的最佳誘導時機；然后在最佳誘導時機下添加終濃度分別為0、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mmol/L的 IPTG,并分別在37 ℃誘導表達4 h和22 ℃誘導表達16 h,分析37 ℃與22 ℃溫度下IPTG濃度對TAT-LUC表達量和活性的影響；最后在確定的最適溫度和 IPTG 濃度條件下,在培養前分別添加終濃度為10、20、30、40、50 mmol/L的 Mg2+,分析Mg2+濃度對目的蛋白表達量和菌體量的影響。

誘導表達后測每個樣品的OD600值,然后各收集菌液2 mL,10 000 r/min、4 ℃離心2 min,棄上清,菌體加入1 mL的PBS重懸,并進行超聲破碎(工作3 s,間歇5 s,功率300 W,循環15次)；各取20 μL超聲后的全菌液進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)；每個樣品另取100 μL誘導表達后的菌液,加入終濃度為150 mg/L的標準底物D-蟲熒光素鈉鹽,混合均勻后立即放于96微孔板發光檢測儀中檢測發光強度。

2.2 細胞培養

A549細胞來自本實驗室,用含有10%胎牛血清和1%雙抗的RPMI-1640培養基,在5%CO2、37 ℃下培養。

2.3 ATP檢測

重組蛋白TAT-LUC通過鎳柱(Ni-NTA)純化。對于無細胞的熒光素酶活性測定,使用無ATP水制備含有50 mg的D-蟲熒光素鈉鹽和5 mmol/L MgCl2的熒光素底物溶液。在無ATP水中連續倍比稀釋ATP得到終濃度為10 μmol/L～10 nmol/L的ATP;將1 μL TAT-LUC(3.1 g/L)或1 μL LUC(0.5 g/L)加入到100 μL不同濃度的ATP溶液中混勻;最終加入終質量濃度為150 μg/mL的底物D-蟲熒光素鈉鹽,立即使用96微孔板光度計檢測熒光素酶活性。對于細胞內ATP含量的檢測,首先將A549細胞倍比稀釋在黑壁96孔細胞培養板中至每孔0至50 000個;然后在100 μL細胞培養基中加入1 μL的TAT-LUC或LUC孵育2 min;最后每孔添加D-蟲熒光素鈉鹽至最終質量濃度為150 mg/L,用96微孔板發光檢測儀檢測發光強度反應酶活性。

3 結果

3.1 不同誘導表達條件對TAT-LUC表達量和活性的影響

從圖1(a)看出,加入誘導劑IPTG時的菌體濃度對質粒表達目的蛋白的影響較大。菌體濃度過低時誘導TAT-LUC表達量較低,過高時表達量反而降低。當OD600為0.6～0.9時加入IPTG可獲得高表達量的TAT-LUC。其中OD600達到0.6時再誘導,發光強度最高即TAT-LUC活性最強,因此此時為最佳誘導時機。OD600超過0.9再加IPTG誘導,雖然菌體量變化不大,但發光強度明顯降低(見圖2(a))。

由圖1(b)可知，37 ℃下終濃度為0.5 mmol/L的IPTG誘導表達4 h后,目的蛋白表達量最高。IPTG濃度過低不利于目的蛋白表達,而濃度過高目的蛋白表達量基本沒變化。37 ℃下IPTG濃度過高會對菌體生長造成毒害作用,使菌體量下降，同時TAT-LUC活性明顯下降(見圖2(b))。同樣在22℃條件下誘導表達16 h,0.5 mmol/L的IPTG誘導目的蛋白表達量最高(見圖1(c))活性最強(見圖2(c)),IPTG濃度過高時則菌體量、目的蛋白表達量和活性基本沒變化,由此可以判斷最佳誘導劑IPTG濃度為0.5 mmol/L。由圖1(d)可知,添加Mg2+濃度在20～50 mmol/L的時對目的蛋白表達量是有促進作用的。Mg2+的濃度對菌體量影響不大,但隨著Mg2+的濃度的增加酶活性逐漸增加(見圖2(d))。

3.2 ATP檢測

對于細胞外ATP檢測,通過比較TAT-LUC和LUC之間的發光強度說明TAT的標記導致在所測試的整個濃度范圍內TAT-LUC相對LUC對ATP反應的敏感性有所降低。然而,TAT-LUC的靈敏度仍然可以檢測10 nmol/L ATP(見圖3(a))。此外,與LUC的可靠性(R2=0.993)相比，TAT-LUC的酶活性與ATP濃度之間有很強的相關性(R2=0.994)。

對于細胞內ATP檢測,將LUC處理后和TAT-LUC處理后的不同細胞數的細胞內發光強度進行了對比。TAT-LUC的發光強度在100個A549細胞中是LUC的14.46倍,并且TAT-LUC可以測量至少50個細胞的細胞內發光。細胞內ATP檢測發現發光強度和細胞數之間存在強相關性(見圖3(b),R2=0.997)。相比之下,用LUC處理后不同細胞數的細胞內發光強度與細胞數量沒有顯著相關性(R2=0.707),發光強度也明顯低于TAT-LUC。

4 討論

熒光素酶法檢測細胞內的ATP時,細胞裂解后ATP的提取過程不可避免,導致細胞內ATP測量不準確。因此研發了一種不用裂解細胞的穿膜肽標記的熒光素酶蛋白(TAT-LUC),為了更快速并精確地檢測活細胞內的ATP含量。本研究在前期構建的穿膜肽標記的熒光素酶基因重組質粒pET28a-TAT-LUC的基礎上,進一步對表達條件的優化做了初步研究,以期能夠得到更高的酶活,為后期腫瘤藥敏快速檢測研究奠定基礎。

圖1 SDS-PAGE分析不同誘導表達條件對TAT-LUC表達量的影響

圖2 不同誘導表達條件對菌體量和TAT-LUC活性的影響

圖3 ATP檢測

將重組質粒轉化到大腸桿菌BL21(DE3)中,對目的蛋白進行誘導表達。在含Mg2+濃度為50 mmol/L的LB培養基中將大腸桿菌培養至OD600為0.6時加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG,22 ℃誘導16 h可獲得大量高活性的TAT-LUC。取誘導表達TAT-LUC的菌液,加入底物后可直接測大腸桿菌表達的目的蛋白的活性。其中在37 ℃下誘導雖然TAT-LUC表達量高，但由于在短時間內快速的蛋白合成使產物大量堆積,以致于沒用足夠的時間進行正確的折疊和二硫鍵配對,形成包涵體沉淀,因此蛋白活性不高,需要進行復雜的蛋白復性過程[10-11]。22 ℃低溫過夜培養下的可溶表達雖蛋白表達量低,但TAT-LUC酶活性高,說明低溫長時間的誘導有利于酶的高活性表達。另外,熒光素酶在催化反應中會將Mg-ATP復合物和底物熒光素的腺苷酸化,然后該腺苷酸的氧化反應以電子激發狀態形成光發射體的氧化熒光素[12]。并且有研究表明,Mg2+、Mn2+、Ca2+都能夠在很大的濃度范圍內提高熒光素酶的活性,并且前兩者的作用效能基本相同,后者的效果能達到前兩者的 60%左右[13]。因此Mg2+作為熒光素酶發光反應的必需離子,對菌體生長和酶活性有一定的影響,在誘導表達過程中有必要添加。

相比LUC,TAT-LUC可以檢測到小于10 nmol/L的ATP,發光強度與ATP含量呈強相關性(R2=0.994),表明TAT的標記不影響熒光素酶與ATP反應的可靠性。由于ATP普遍存在于一切活細胞內,細胞死亡后細胞內ATP迅速水解,而活細胞的ATP含量基本固定,因此所測得的發光強度能夠反映出活細胞的數量。不進行細胞裂解,TAT-LUC至少可以檢測40個細胞內的ATP,發光強度與ATP含量同樣呈強相關性(R2=0.997)。結果與對細胞裂解提取ATP的許多報道一致,表明ATP生物發光的強度與細胞數成正比[14]。與TAT-LUC相比,對照的LUC細胞內低敏感性顯然是由于細胞不能對其攝取所導致的。總體來說,雖然TAT標記降低了細胞外ATP檢測的靈敏度,但它顯著提高了細胞內檢測的靈敏度和可靠性,突顯了TAT-LUC在活細胞內ATP測量中的應用,為實時進行藥物動力學研究及細胞毒性測定提供了一種新的檢測方法。該方法無需裂解細胞提取ATP,避免了ATP提取過程中的降解及操作誤差上的損失,能更加準確的測定活細胞內的ATP含量,實時進行藥物動力學研究及細胞毒性測定。

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