杏鮑菇培養基發酵前后的理化性質實驗研究

戎念杭,羅小芳,歐陽超,張 星,曾 彭,栗海波,張 永,沈凡超,覃佐東,

(1.浙江大學 分析測試中心,浙江 杭州 310058；2.湖南科技學院 化學與生物工程學院,湖南 永州 425199； 3.湖南省宇秀生物科技有限公司,湖南 永州 425000)

杏鮑菇(Pleurotuseryngii)隸屬擔子菌綱、傘菌目、側耳科、側耳屬，是一種名貴珍稀食用菌,富含多糖、膳食纖維、蛋白質、碳水化合物以及多種礦物質元素,具有抗腫瘤、降血壓及潤腸道等功效,是一種營養保健價值極高的食用菌[1]，已成為我國又一重要食用菌。根據產業信息網統計,杏鮑菇產量近5年內以超過10%的增長率持續增長,2015年中國杏鮑菇產量達到110萬噸,產值達65億元,占同期國內食用菌總產量的3.1%[2]。

由于杏鮑菇的生長周期較短,生物轉化效率低,不能充分地利用培養料的營養成分,導致菌糠中富含纖維素、半纖維素、木質素、菌絲體及經菌絲體生物轉化生成的糖類、有機酸和生物活性物質等[3],這與平菇對營養物質的需求極為相似,可作為栽培平菇的原料。另外，其表面豐富的羥基、羰基、羧基、酰胺基、磷酸基等還可以螯合廢水中的金屬陽離子[4]。本文對杏鮑菇培養基發酵前后的理化性質進行分析,為杏鮑菇培養基的篩選與優化以及菌糠的二次利用提供理論依據。

1 實驗材料

1.1 實驗原料與試劑

原料:杏鮑菇，原始的未經過發酵處理的杏鮑菇培養基(湖南省宇秀生物科技有限公司)，培養杏鮑菇29 d后菌糠(發酵培養后的菌糠)。

試劑:溴化鉀,硫酸銅,無水氯化鈣,濃鹽酸,濃硝酸,氫氟酸,高氯酸，都為分析純，天津市福是化學試劑廠。

1.2 實驗儀器

主要儀器:HNY—200D恒溫培養振蕩器，TDD5M長沙平凡儀器儀表有限公司離心機，UV—2800型紫外分光光度計，PerkinElmer NexIon 300X 型電感耦合等離子體質譜儀，Dionex ICS-2000 離子色譜儀，傅里葉變換紅外光譜儀(AVATAR 370 FT-IR，Thermo Nicolet公司)，微波消解儀(Multiwave PRO，Anton Paar公司)，場發射掃描電鏡(SU8010，日本HITACHI公司)。

2 實驗方法

通過對杏鮑菇培養基發酵前后進行離子色譜分析、紅外吸收光譜分析、電感耦合等離子體質譜儀分析、掃描電子顯微鏡及X射線能譜分析,對發酵前與發酵后菌糠的化學成分、分子結構與化學鍵及表面的形態結構進行比較,為杏鮑菇培養基的篩選和優化提供可靠的理論基礎。

2.1 杏鮑菇培養基發酵前后的掃描電鏡觀察

隨機取發酵前后的杏鮑菇培養基樣品各0.5 g左右,均勻鋪撒在粘有碳導電膠、直徑為50.8 mm(2英寸)的掃描電鏡樣品臺上,在離子濺射儀中噴涂鉑金(Pt)60 s后,將樣品置于場發射掃描電鏡中,在加速電壓3 kV、工作距離10 mm,放大倍數80～3 500倍下觀察[5]。

2.2 發酵前后杏鮑菇培養基的紅外光譜檢測

隨機各取0.5 g左右的發酵前后杏鮑菇培養基樣品，分別與100.0 mg溴化鉀混勻,在研缽中研勻至200目,移入壓模機內壓制成直徑13 mm的錠片,迅速放入傅里葉變換紅外光譜儀(AVATAR 370 FT-IR;Thermo Nicolet公司)進行檢測分析,波數為400～4 000 cm-1。

2.3 發酵前后杏鮑菇培養基的陰陽離子測定

將發酵前后杏鮑菇培養基樣品磨碎,用20目篩子過篩,準確稱取樣品0.5 g,將其放在洗凈的坩堝中,用去離子水將樣品濕潤,加入5 mL濃鹽酸于聚四氟乙烯坩堝中,蓋上蓋,放置電熱板上(控制電熱板溫度在 200 ℃)消解至無酸；加入5.0 mL濃硝酸和2.0 mL濃高氯酸,放置電熱板上加熱至有白色晶體產生(若消解未完全則繼續按照5∶2的比例加入濃硝酸和濃高氯酸,直至白色晶體產生)；消解完全后,揭開蓋,去除酸(白色霧氣冒出位置),將白色晶體用1.0%的稀硝酸轉移至50.0 m L的容量瓶中定容[4],用定性濾紙將容量瓶中的液體過濾,即制成消解液；將消解后的樣品,吸取25.0 μL放在ICS-1500型離子色譜儀中進行分析[6]。

2.4 發酵前后杏鮑菇培養基的重金屬含量測定

隨機取發酵前后杏鮑菇培養基樣品0.2 g,加入7.0 mL HNO3,在110 ℃條件下預處理30 min后放入微波消解儀；600 W中升溫5 min,600 W中平衡5 min,1 000 W中升溫10 min,1 000 W中平衡15 min;取出后再在110 ℃條件下加酸至1～2 mL,用水定容至50.0 mL;過濾后放入NexIon 300X型電感耦合等離子體質譜儀進樣器中檢測。

3 實驗結果與分析

3.1 掃描電鏡(SEM)及能譜元素分析

對發酵前后杏鮑菇培養基進行掃描電鏡觀察可以發現,發酵后杏鮑菇培養基主要由木屑、菌絲體、木材提取物及少量灰分等組成,其表面相比于發酵前培養基更加粗糙,這主要與木屑中纖維素與半纖維素的結構被破壞有關。在這些被破壞的纖維絲之間存在諸多微小空隙,通過水溶液中的振蕩,可觀察到更多的木質片層碎片和內部填充物溶出[7]。在放大倍數為80、100、150、500時,結果見圖1。

從圖1中可以看出,未經發酵的培養基由于沒有杏鮑菇酶的降解,培養基質的表觀結構緊密、規整(見圖1(a))，而發酵后的培養基表面呈現不規則的褶皺結構,這是主要是由于杏鮑菇菌絲體在生長過程中,分泌出某種激素物質和特殊的酶,使培養基中的木質素、纖維素和半纖維素等有機物質分解[8]；從圖1(c)中,能清晰地發現發酵后的培養基表面被酶解,其表面吸附面積大大提升;圖1(d)中明顯變得粗糙、質地相對緊密,且具有許多微觀孔洞、溝壑和褶皺,這主要是因為經過發酵后的培養基表面被腐殖化,培養基中的纖維結構被菌絲體分泌的酶系穿透、降解,遭到了嚴重的破壞,產生出很多的裂縫和空洞。經過對比分析可以發現,發酵后的培養基其表面積得到很大程度的提升,比發酵前的培養基具有更強的吸附性能,這為菌糠作為土壤基質、有機肥料等原料提供了更可行、安全的論證。

利用能譜儀在每個樣品表面隨機抽取3點做元素的能譜分析,得到樣品表面各元素質量分數見表1。從表1中可以看出，發酵后培養基較發酵前培養基中的碳百分數含量降低4.84。碳作為培養基組成的主要成分之一,其主要功能有2個:一是為微生物細胞提供炭素和碳架；二是為微生物生命活動提供能源,杏鮑菇既可以利用成分復雜的復合碳源,又可以利用單糖和雙糖等小分子碳源[9],但利用復合碳源的效果明顯低于小分子碳源。另外，杏鮑菇在生長過程中對Mg、P、K元素也表現出不同的吸收,其中杏鮑菇對K元素的吸收最為明顯,這主要與對磷酸二氫鉀的利用率有關。郭智等[10]在對杏鮑菇培養基做優化實驗過程中發現,磷酸二氫鉀可作為無機鹽促進杏鮑菇菌絲的生長,其質量分數為0.5%時促進效果尤為明顯,Mg元素主要以硫酸鎂的形式促進杏鮑菇生長,對比發酵前后Mg元素含量變化不明顯。

表1 杏鮑菇培養基發酵前后的能譜元素分析

表中數據:平均值± 標準偏差

3.2 紅外光譜分析

圖2為發酵前后的紅外光譜圖,經過對比可知:發酵后1 645 cm-1處吸收峰和發酵前1 652 cm-1處吸收峰對應為醇羥基(呈現彎曲振動)[11]；發酵后1 645 cm-1處吸收峰相對比例增加；發酵前菌糠與發酵后菌糠在3 300～3 650 cm-1區域均有吸收峰,該峰對應的官能基團為締合態羥基,發酵后該區域吸收峰的寬度比發酵前更寬,可能是由于杏鮑菇生長過程中產生的漆酶將木質素分解[11],導致木質素中的酚羥基暴露出來。有關研究表明,從多種新鮮食用菌子實體中提取漆酶,發現杏鮑菇漆酶的酶活性最高,其酶學性質的研究對今后漆酶的應用提供有價值的理論數據[9]。發酵后1 055 cm-1處吸收峰和發酵前1 051 cm-1處吸收峰對應木質素中的醚基C—O—C,且呈現伸縮振動[11],而發酵后在該區域的吸收峰相對比例減少,與發酵過程醚水解過程相符,進一步說明在發酵過程部分木質素被分解。發酵前有β-纖維素特征吸收峰在1 424 cm-1,發酵后消失,說明β-纖維素結構被分解,與上述分析一致。發酵后1 323 cm-1相對比例增加,該峰對應O—H彎曲振動[11],說明O—H相對比例增加,與木質纖維素被水解有關。上述的發酵后3 405 cm-1處寬峰(O—H伸縮振動)比發酵前變寬也與醇羥基相對比例有關。因而可以解釋:由于發酵后醇羥基相對比例增加,導致發酵后吸附水比例相應增加。

3.3 培養基的陰陽離子分析與優化

ICS-1500型離子色譜儀分析結果見表2。

圖2 杏鮑菇培養基發酵前后的紅外光譜分析

表2 發酵前后杏鮑菇培養基陽離子和陰離子含量

在杏鮑菇液體培養基優化研究中表明,在杏鮑菇培養基中加入磷酸二氫鉀能有效提高菌絲得率和胞外多糖得率。李志濤等[14]研究發現,杏鮑菇液體培養基優化配方比為:黃豆粉3%、酵母膏0.1%、葡萄糖3%、硫酸鎂0.05%、硫酸鐵0.01%、磷酸二氫鉀0.05%、維生素B10.001 %時,菌絲得率和胞外多糖得率分別達 9.692 g/L和537 mg/L。此配方與未經優化組合相比較,菌體和多糖產量分別提高了6.3 %、7.6 %。因此,如果這些物質能夠得到有效利用,對降低食用菇的生產成本及提高它的品質有重要的意義。

3.4 各種組分及重金屬含量評估

利用凱氏定氮儀、纖維分析儀和梅特勒水分儀對杏鮑菇發酵前后培養基中的各組分進行測量，結果見表3。發酵前后蛋白質及纖維素含量均有顯著提高,蛋白質含量提高了22.65%,這主要是由于杏鮑菇菌絲體生物固氮作用,將原有的無機氮轉為有機氮,使廢棄菌糠發酵后的粗蛋白和粗脂肪的含量提高；纖維素含量提升45.61%,可能是因杏鮑菇培養基中的木質素被降解,使纖維素、與半纖維素的比例增加。李令堂等[15]研究發現,當杏鮑菇廢料添加量為30%～40%時,平菇菌絲體的長速、長勢、滿袋天數,平菇產量總和,生物學效率,子實體的直徑、菌柄長度、菌蓋厚度均與對照基本相同,均可以達到良好的生產效果,適宜替代部分棉籽殼、玉米芯作為平菇培養基的原料。

表3 杏鮑菇培養基發酵前后的成分分析 %

重金屬元素分析結果見表4。從表4中可看出,培養基發酵后,Pb和Mn的含量增加最為明顯,As、Cu、Cd、Ni和Zn也有不同程度的增加。施巧琴等[16]研究表明:食用菌對重金屬的積累主要通過體內生物大分子與重金屬離子結合形成不溶性物質或沉淀,以及細胞壁對重金屬的吸附作用。外生菌根真菌基本上都是高等擔子菌,它們對金屬具有較強的耐受性,其耐受性機理主要有離子交換、形成絡合物、沉淀作用和結晶化作用等,食用菌還有一些其他的重金屬耐受機制,如將重金屬排除體外、形成金屬絡合物等,從而減輕重金屬對自身的毒害,富集較高濃度的重金屬。參考《中華人民共和國農業行業標準》NY525—2012可知,標準僅對砷、汞、鉛、鎘、鉻等5項指標做出了安全限制規定,實驗數據結果表明,廢棄菌糠中5項指標符合其要求,因此,將菌糠發酵腐熟后作為有機肥料施入土壤中,不僅能夠充分利用菌糠內部蘊涵的豐富的營養物質,而且對重金屬污染土壤有一定的修復作用。

表4 培養基發酵前后的元素含量分析 μg·g-1

4 結論

本文采用傅里葉紅外光譜(FTIR)、電感耦合等離子體質譜儀(ICP-MASS)、離子色譜儀(ICS)、場發射掃描電鏡(FESEM)和能譜等檢測手段,對杏鮑菇培養基發酵前后各種元素含量、營養物質的變化規律和形貌分析測試與對比,通過實驗研究和數據分析得出以下結論:

(1) 發酵過程中杏鮑菇可通過自身合成漆酶將木質素降解,使醇羥基相對比例增加,進而引起發酵后吸附水比例相應增加；

(2) 杏鮑菇培養基內含有大量已分解但尚未利用的小分子營養物質,并且殘留菌絲豐富了培養基中的蛋白營養,其粗蛋白的含量相比發酵前培養基提高了22.65%,這些營養物質可以被平菇有效利用,作為栽培平菇的原料；

(3) 發酵后培養基中砷、汞、鉛、鎘、鉻等5項指標均達到安全限制規定。因此,以發酵后培養基為基質作覆土直接施用的多向利用的可行性、安全性均得以保障,并且不會對環境造成二次傷害,可實現廢棄物的循環利用；

(4) 通過離子色譜儀檢測的結果表明,發酵前的杏鮑菇培養基富含鉀、鈣、鎂和磷等多種營養元素,經過發酵后,鉀、鎂、磷元素被不同程度吸收,鈣元素的含量有所提升,為杏鮑菇的培養基篩選和優化提供了理論基礎；

(5) 通過場發射掃描電鏡觀察,發酵后的杏鮑菇培養基表面因酶解作用而出現許多皺褶和不規則的多孔結構,可有效提高基質對水分的吸附性能,其表面豐富的羥基、羰基、羧基、酰胺基、磷酸基等還可以螯合廢水中的金屬陽離子,這為菌糠作為二次培養基質、土壤基質、有機肥料等原料提供了理論依據。

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