ApoB基因多態性與冠心病研究進展*

陳 蕓 綜述，呂 湛，宋永硯 審校

(1.川北醫學院附屬醫院心內科，四川南充 637000；2.川北醫學院基礎醫學院生物化學教研室，四川南充 637000)

載脂蛋白B(ApoB)是載脂蛋白家族中相對分子質量最大的成員，包括ApoB100和ApoB48兩種亞型。人ApoB100含有4 563個氨基酸殘基，相對分子質量516×103；ApoB48含有2 152個氨基酸殘基，相對分子質量270×103。在血漿中，所有致動脈粥樣硬化性脂蛋白顆粒均含有一分子ApoB，其中乳糜微粒(CM)含有ApoB48，極低密度脂蛋白(VLDL)、中間密度脂蛋白(IDL)、低密度脂蛋白(LDL)和脂蛋白含有ApoB100。ApoB是致動脈粥樣硬化性脂蛋白的主要結構蛋白，也是被低密度脂蛋白受體(LDLR)所識別的功能蛋白，在調節脂蛋白代謝中有重要作用。具有抗動脈粥樣硬化特性的高密度脂蛋白(HDL)不含有ApoB，因此在臨床上ApoB的血漿水平一般反映個體的心血管疾病風險性。ApoB與動脈粥樣硬化和冠心病(coronary heart disease,CHD)顯著相關。PENCINA等[1]研究發現，血漿ApoB水平與低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和非高密度脂蛋白膽固醇(non-HDL-C)相比較，其與心血管事件的關系更為密切。THANASSOULIS等[2]對7項安慰劑對照-他汀試驗進行Meta分析，綜合評價他汀治療后ApoB、LDL-C和non-HDL-C等指標對心血管風險降低的評價效果，結果顯示ApoB對他汀治療后心血管風險降低程度的評價效果最好，ApoB每降低一個單位，CHD風險降低程度比LDL-C多21.6%，比non-HDL-C多24.3%。本文綜述了近年來ApoB基因多態性與CHD相關性的研究進展及內在的分子機制。

1 ApoB基因及其多態性

ApoB100和ApoB48由同一ApoB基因編碼。ApoB基因位于人類2號染色體短臂上(2p23-24)，含有29個外顯子和28個內含子，全長43 kb。ApoB基因呈現高度多態性，在美國國家生物技術信息中心(NCBI)SNP數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)中查詢，人ApoB基因內部及周圍有大約5 000個多態性位點，其中絕大部分分布在外顯子和內含子區。根據這些多態性位點的特征可分為單核苷酸多態性，小片段插入/缺失多態性，小片段串聯重復次數多態性；根據在基因中的分布位置可分為5′端啟動子區域多態性、外顯子區域多態性、內含子區域多態性和3′端調控區多態性。在NCBI SNP數據庫中登記注冊的5′端啟動子區多態性有122個(rs512535、rs934197等)，外顯子區多態性位點有2 742個(rs693、rs676210等)，內含子區多態性有2 007個(rs12714269、rs12720826等)，3′端調控區多態性有67個(rs11687484、rs57437972等)。

2 ApoB基因多態性與CHD研究進展

一系列病例-對照研究結果顯示，ApoB基因上的一些多態性位點與CHD顯著相關。其中，啟動子區的rs934197位點，外顯子區的rs17240441、rs1042031、rs693和rs1801701位點及3′端調控區的VNTR位點與CHD的相關性較強。

2.1ApoB基因啟動子區多態性與CHD 在ApoB基因啟動子區的122個多態性位點中，rs934197(-516C/T)被報道與CHD顯著相關，也有研究[3]探討rs512535位點與CHD的關系，但沒有發現二者之間具有顯著相關性。rs934197位點位于轉錄起始點上游-516 bp處，由胞嘧啶(C)變異成胸腺密度(T)產生。研究顯示，T為CHD風險等位基因[1-2]。T等位基因頻率在亞洲人中為0.12～0.29，高加索人中為0.30～0.38，非洲人中為0.09。我國漢族人群中發現T等位基因和TT基因型在CHD組中的出現頻率顯著高于對照組，回歸分析顯示T等位基因攜帶者較非攜帶者CHD發病風險顯著增高。rs512535多態性位于ApoB基因轉錄起始點上游-837 bp處，由腺嘌呤(A)變異成鳥嘌呤(G)生成。有關這個位點與CHD相關性的研究報道較少，在最近一項研究中，LIU等[4]在550例CHD患者和550名健康對照之間比較了rs512535多態性的基因型分布頻率，在兩組之間的差異沒有統計學意義。

2.2ApoB基因外顯子區多態性與CHD 在ApoB基因外顯子區的2 742個多態性位點中，rs17240441、rs1042031、rs693和rs1801701位點被廣泛報道與CHD相關。

2.2.1rs17240441位點與CHD rs17240441位點位于ApoB基因第1外顯子的信號肽編碼序列內，由9個核苷酸小片段(GCAGCGCCA)的插入/缺失(Ins/Del)變異產生，結果導致ApoB蛋白信號肽中3個氨基酸殘基(Arg-Glu-Val)的插入或缺失，Ins等位基因信號肽含有完整的27個氨基酸殘基，Del等位基因信號肽只有24個氨基酸殘基。研究顯示，Del等位基因是CHD風險等位基因[3]，其出現頻率在亞洲人中為0.12～0.39，高加索人中為0.21～0.64，非洲人中為0.23～0.68。來自非洲突尼斯的一項病例-對照研究[3]結果顯示，Del等位基因顯著增加CHD患病風險。在高加索人中，以捷克男性為研究對象發現CHD組Del等位基因頻率顯著高于對照組。在亞洲人中，來自我國的一項病例-對照研究[5]沒有發現Del等位基因與CHD顯著相關。研究結果不一致的原因可能來自于樣本量、實驗設計及種族差異。LI[6]通過Meta分析綜合以往的研究數據，降低或消除樣本量、實驗處理和種族對結果的影響，分析結果顯示Del等位基因和CHD顯著相關。最近，ZHANG等[7]進一步按種族進行亞組分析，發現在中國人中Del等位基因與CHD的相關性無統計學意義，在其他人種中二者顯著相關。在中國人中Del等位基因與CHD的關系有待進一步探討。

2.2.2rs1042031位點與CHD rs1042031(EcoRI)是存在于ApoB基因第29外顯子的一個錯義突變位點，由G變異成A生成，相應地ApoB多肽鏈第4 181位氨基酸殘基由谷氨酸(Glu)變成賴氨酸(Lys)。Glu和Lys雖然都是極性氨基酸，但酸堿性質不一樣(Glu是酸性氨基酸，Lys是堿性氨基酸)，ApoB蛋白的結構和功能可能因此而改變。研究表明，A等位基因是CHD的風險等位基因，其出現頻率在亞洲人中為0.02～0.09，高加索人中為0.12～0.21，非洲人中為0.15～0.18。在我國漢族人群中，YE等[5]研究發現CHD組的A等位基因頻率顯著高于對照組，但另外兩項病例-對照研究(均為漢族人群)卻沒有發現A等位基因與CHD相關[8-9]。最近，陳業達等[10]針對我國人群作了rs1042031與CHD易感性的Meta分析，對1992-2013年來自我國的10項類似研究進行數據合并，結果顯示rs1042031與CHD顯著相關，A等位基因是風險等位基因，該結果與同時期發表的另一項Meta分析一致[7]。在高加索人群中，報道rs1042031與CHD顯著相關，與對照組比較，A等位基因頻率在CHD組顯著升高。來自美國的一項針對超重/肥胖人群的研究中[11]，研究者分析了34個基因上的136個多態性位點，發現rs1042031和其他3個位點(ApoB rs1800479，CETP rs5880和LDLR rs2569538)與CHD顯著相關。TYBJAERG-HANSEN等[12]的研究中沒有觀察到rs1042031與CHD顯著相關。通過Meta分析，合并了1992-2000年針對高加索人的10項病例-對照研究，結果顯示rs1042031與CHD沒有顯著相關性。rs1042031與CHD的相關性有待進一步研究，需要進一步的Meta分析對近年來新增加的研究數據進行合并，以明確二者之間的關聯性。

2.2.3rs693位點與CHD rs693(XbaI)是存在于ApoB基因第26外顯子的一個同義突變位點，由C變異成T生成，變異使第2 488位密碼子由ACC變成ACT，但所編碼的氨基酸并不發生改變，仍為蘇氨酸(Thr)。次要等位基因T出現頻率在亞洲人中為0.02～0.10，高加索人中為0.49～0.50，非洲人中為0.15～0.23。雖然國內外對rs693多態性與CHD易感性進行了大量的研究報道，但二者之間的關系還無定論，一些研究[5,9,13]表明T等位基因是CHD的風險等位基因，另一些研究[7,14-15]卻報道C等位基因與CHD易感關聯，還有一些研究[3,8,16-19]報道二者不相關。在亞洲人中，來自我國的兩項病例-對照研究均發現rs693與CHD顯著相關[5,9]，T等位基因攜帶者CHD易感性顯著升高，但在其他一些來自亞洲的研究中，包括漢族人[8,16]、哈薩克人[17-18]、印度人[3]、韓國人和日本人[19]，卻并沒有發現二者之間具有相關性。相反，馬娟等[14]報道T等位基因頻率在CHD組顯著低于對照組。在近年來針對中國人做的Meta分析結果也不盡一致，陳業達等[13]對1992-2013年發表的16項病例-對照研究進行數據合并，結果顯示rs693與CHD顯著相關，T等位基因是CHD的易感等位基因。然而，ZHANG等[7]和CHEN等[15]的Meta分析卻得出了相反的結果，在中國人中T等位基因攜帶者CHD發病風險顯著降低。究其原因，這兩項發表于2015年的Meta分析都存在納入文獻不全，在陳業達等[13]納入的16篇文獻和ZHANG等[7]納入的15篇文獻中，僅5篇文獻是相同的，其他大部分文獻沒有納入分析。在高加索人中，迄今還沒有研究證明T等位基因是CHD的風險等位基因，相反，研究報道[12]T等位基因是CHD的保護性等位基因。有趣的是，在一項針對高加索人的Meta分析中，報道盡管T等位基因攜帶者LDL-C和ApoB水平升高，但CHD發病率卻顯著降低。rs693多態性與CHD易感性之間的關系還有待于進一步研究，在中國人中需要全面檢索文獻進行Meta分析，在高加索人中還需要設計大樣本、多中心的病例-對照研究進一步探索。

2.2.4rs1801701位點與CHD rs1801701(MspI)是存在于ApoB基因第26外顯子的一個錯義突變位點，由G變異成A生成。該變異導致ApoB多肽鏈3 611位氨基酸殘基由精氨酸(Arg)變成谷氨酰胺(Gln)。研究表明，次要等位基因A可能是CHD易感等位基因，其出現頻率在亞洲人中為0～0.08，高加索人中為0.09～0.15，非洲人中為0.01～0.06。徐瓊等[20]在我國漢族人群中，發現rs1801701多態性與CHD顯著相關，A等位基因在CHD組的出現頻率顯著高于健康對照組。在高加索人中，發現A等位基因在CHD組的出現頻率較對照組顯著升高。但在其他幾項研究中，研究人群包括中國漢族人[8]、中國哈薩克人[18]和高加索人[12]，均沒有發現rs1801701多態性與CHD易感性存在顯著關聯性。需要Meta分析對這些類似研究進行合并，消除樣本量、種族和環境因素對研究結果的影響，以明確rs1801701多態性與CHD的關系。

2.2.5其他外顯子多態性位點與CHD 在外顯子區，除了rs17240441、rs1042031、rs693和rs1801701位點與CHD相關性研究報道較多外，其他位點如rs1367117(外顯子4)[11]、rs679899(外顯子14)[4,11]、rs676210(外顯子25)[4]和rs1042034(外顯子29)[11]等與CHD的相關性也有一些報道。在這些位點中，僅rs676210被報道與CHD顯著相關，G等位基因顯著增加CHD患病風險[4]。rs676210是位于第25外顯子的一個錯義突變，由G變異成A生成，所對應的2 739位脯氨酸殘基變成亮氨酸殘基。

2.3ApoB基因內含子區多態性與CHD ApoB基因內含子區多態性位點與CHD的相關性研究報道不多，盡管大多數內含子區變異位點對CHD易感性沒有顯著影響[4,11]，但也有少數研究結果顯示位于內含子區的多態性位點也會顯著影響CHD發病率。來自美國西弗吉尼亞州的一項研究[11]發現，在超重/肥胖高加索人群中，位于第27內含子的rs1800479多態性與CHD顯著相關，次要等位基因G是CHD易感等位基因。在我國漢族人群中，朱名安等[21]報道存在于第20內含子的四核苷酸串聯重復序列 (TTTA)n多態性與CHD顯著相關，重復12次的等位基因可能是CHD易感等位基因。一些基因表達調控元件存在于內含子，因此如果變異位點存在于內含子區的表達調控元件內，也就會影響基因表達和CHD易感性[22]。

2.4ApoB基因3′調控區多態性與CHD 在ApoB基因3′端最后一個外顯子(第29外顯子)下游185 bp處，存在1個15 bp(ATA ATT AAA TAT TTT)的可變數目串聯重復序列多態性(variable number tandem repeat,VNTR)，其重復次數在亞洲人中為22～60次，高加索人中為25～53次，非洲人中為31～51次。一般將重復次數在36次以上命名為大等位基因，小于36次命名為小等位基因。一系列研究結果顯示大等位基因可能是CHD易感等位基因。YE等[5]在我國漢族人群中研究發現大等位基因(重復次數大于39)頻率在CHD組中較對照組顯著升高，這一研究結果與后來的研究[23]一致。在高加索人群中，發現重復次數大于或等于38的大等位基因與CHD顯著相關。來自非洲的研究[3]也發現重復次數大于36的大等位基因在CHD組的出現頻率較對照組顯著增加。但是其他幾項來自亞洲[24]和歐洲的病例-對照研究沒有觀察到VNTR多態性與CHD顯著相關。需要Meta分析對這些研究數據進行合并，消除樣本量、種族等影響，以明確VNTR多態性與CHD的相關性。

3 ApoB基因多態性與CHD的關聯機制

血脂異常是CHD的主要危險因素，占人群歸因危險度的50%。ApoB基因多態性主要通過改變血脂水平而影響CHD的發生、發展。

3.1通過升高血漿ApoB水平導致CHD 所有致動脈粥樣硬化性脂蛋白顆粒(包括CM、VLDL、IDL、LDL和脂蛋白a)均含有1分子ApoB，因此ApoB的血漿濃度反映了致動脈粥樣硬化性脂蛋白顆粒數量的多少。致動脈粥樣硬化性脂蛋白顆粒數量與CHD密切相關，顆粒數越多，CHD發病風險越高[25]。因此，ApoB血漿水平升高，CHD發病風險增加。與ApoB血漿水平升高相關聯的ApoB基因多態性位點有5′端啟動子區的rs934197[26]，外顯子區的rs17240441[3]、rs1042031、rs693和rs676210[4]，3′端調控區的VNTR多態性。這些變異位點升高ApoB血漿水平的機制之一是促進ApoB基因表達，SPOSITO等[26]在肝細胞HepG2中分別轉入含rs934197 CC和TT基因型的ApoB基因，結果TT基因型的ApoB基因表達顯著增強。

3.2通過升高血漿三酰甘油(TG)水平導致CHD 高三酰甘油血癥(HTG)是動脈粥樣硬化的獨立危險因子，與CHD直接相關[27-28]。血漿TG水平升高是構成CHD剩留風險的重要表型。研究顯示，即使他汀類藥物治療使LDL-C水平達標，血漿TG增高者(TG≥200 mg/dL)發生急性冠脈綜合征的風險仍較TG<200 mg/dL者增高50%。與血漿TG水平升高相關聯的ApoB基因多態性位點有第26外顯子的rs693位點[29]，第29外顯子的rs1042031位點和3′端調控區VNTR多態性。

3.3通過升高血漿TC和LDL-C水平導致CHD 高膽固醇血癥是動脈粥樣硬化的獨立危險因素。美國國家膽固醇教育計劃(NCEP)成人治療組第3次報告和2013美國心臟病學會/美國心臟協會(ACC/AHA)治療血膽固醇降低成人動脈粥樣硬化性心血管疾病(ASCVD)風險指南[30]均認為LDL-C是導致CHD的主要危險因素，作為預防和治療CHD的一級指標，其他脂質參數作為二級或補充指標。與血漿TC水平升高相關聯的ApoB基因多態性位點有啟動子區的rs934197位點[18,20]，外顯子區的rs17240441和3′端調控區VNTR多態性[23]。與血漿LDL-C水平升高相關聯的ApoB基因多態性位點有啟動子區的rs934197位點[26]和外顯子區的rs17240441。

3.4通過降低血漿HDL-C水平導致CHD HDL的功能是將膽固醇逆向轉運至肝，肝臟將膽固醇轉變為膽汁酸，再通過膽道系統排出體外。HDL-C水平降低意味著逆向轉運至肝的膽固醇減少，膽固醇滯留于血漿，導致動脈粥樣硬化。與血漿HDL-C水平降低相關聯的ApoB基因多態性位點有外顯子區的rs17240441[29]和rs693[14]，3′端調控區VNTR多態性[9]。

4 展 望

近年來，各國科學家對ApoB基因多態性與CHD的相關性做了大量的探索性工作，基本明確了啟動子區的rs934197位點，外顯子區的rs17240441、rs1042031、rs693和rs1801701位點和3′端調控區的VNTR位點與CHD相關聯，也進行了初步的機制探討。但是，絕大部分研究結果來自于小樣本的病例-對照研究，研究群體單一，更沒有進行多群體的相互印證。部分位點的研究結果不一致，甚至相互矛盾。因此，需要開展多中心、多種族、大樣本的前瞻性病例-對照研究，甚至全基因組關聯分析(GWAS)，明確ApoB基因內的CHD易感多態性位點，為闡明CHD發病的遺傳機制及其防治提供理論依據。

[1]PENCINA M J,D′AGOSTINO R B,ZDROJEWSKI T A,et al.Apolipoprotein B improves risk assessment of future coronary heart disease in the Framingham Heart Study beyond LDL-C and non-HDL-C[J].Eur J Prev Cardiol,2015,22(10):1321-1327.

[2]THANASSOULIS G,WILLIAMS K,YE K Y,et al.Relations of change in plasma levels of LDL-C,Non-HDL-C and apoB with risk reduction from statin therapy:a Meta-Analysis of randomized trials[J].J Am Heart Assoc,2014,3(2):e000759.

[3]LAMIA R,ASMA O,SLIM K,et al.Association of four apolipoprotein B polymorphisms with lipid profile and stenosis in Tunisian coronary patients[J].J Genet,2012,91(1):75-79.

[4]LIU C Q,YANG J,HAN W,et al.Polymorphisms in ApoB gene are associated with risk of myocardial infarction and serum ApoB levels in a Chinese population[J].Int J Clin Exp Med,2015,8(9):16571-16577.

[5]YE P,CHEN B S,WANG S W.Association of polymorphisms of the apolipoprotein B gene with coronary heart disease in Han Chinese[J].Atherosclerosis,1995,117(1):43-50.

[6]LI Y Y.ApoB gene SpIns/Del,XbaI polymorphisms and myocardial infarction:a meta-analysis of 7169 participants[J].J Cardiovasc Med,2014,15(9):717-726.

[7]ZHANG J Z,ZHENG Y Y,YANG Y N,et al.Association between apolipoprotein B gene polymorphisms and the risk of coronary heart disease (CHD):an update meta-analysis[J].J Renin Angiotensin Aldosterone Syst,2015,16(4):827-837.

[8]PAN J P,CHIANG A N,TAI J J,et al.Restriction fragment length polymorphisms of apolipoprotein B gene in Chinese population with coronary heart disease[J].Clin Chem,1995,41(3):424-429.

[9]李順輝，熊強珍．載脂蛋白B,E基因多態性與老年高血壓病和冠心病相關性分析[J]．中國醫療前沿，2013，8(18)：87-88．

[10]陳業達，趙翔，譚藝青，等．中國人群ApoB EcoRI基因位點多態性與冠心病關聯性的Meta分析[J]．中國動脈硬化雜志，2015，23(10)：1056-1060．

[11]DEMENTIEVA Y,GREEN T L,PRIMERANO D A,et al.Identification of genes contributing to cardiovascular disease in overweight and obese individuals from West Virginia[J].W V Med J,2012,108(1):23-30.

[12]TYBJAERG-HANSEN A,NORDESTGAARD B G,GERDES L,et al.Variation of apolipoprotein B gene is associated with myocardial infarction and lipoprotein levels in Danes[J].Atherosclerosis,1991,89(1):69-81.

[13]陳業達，林關華，譚藝青，等．中國人群ApoB XbaI基因位點多態性與冠心病關聯性的Meta分析[J]．國際遺傳學雜志，2015，38(6)：335-343．

[14]馬娟，陳吉麗．AGT,ApoB,ApoE,MTHFR,eNOS基因多態性與昆明地區冠心病的關系[J]．山東醫藥，2013，53(9)：16-19．

[15]CHEN Y D,LIN M H,LIANG Y,et al.Association between apolipoprotein B XbaI polymorphism and coronary heart disease in Han Chinese population:a meta-analysis[J].Genet Test Mol Biomarkers,2016,20(6):304-311.

[16]黃剛，謝印軍．載脂蛋白B基因EcoRI,XbaI及載脂蛋白AI-75 bp,+83 bp位點多態性與冠心病的關系[J]．臨床內科學雜志，2011，28(2)：132-135．

[17]BERKINBAYEV S,RYSULY M,MUSSAYEV A,et al.Apolipoprotein gene polymorphisms(APOB,APOC111,APOE)in the development of coronary heart disease in ethnic groups of Kazakhstan[J].J Genet Syndr Gene Ther,2014,5(2):216-238.

[18]HUANG G,ZHONG H,RE H M,et al.Coalition of DNA polymorphisms of ApoB and ApoAI genes is related with coronary artery disease in Kazaks[J].J Geriatr Cardiol,2012,9(1):33-37.

[19]TAKEUCHI F,ISONO M,KATSUYA T,et al.Association of genetic variants influencing lipid levels with coronary artery disease in Japanese individuals[J].PLoS One,2012,7(9):e46385.

[20]徐瓊，周新．載脂蛋白B基因MspI多態性分析及其臨床應用[J]．臨床檢驗雜志，1998，16(4)：199-202．

[21]朱名安，周新，賀小玲，等．載脂蛋白B四核苷酸串聯重復序列基因多態性與冠心病的關聯性研究[J]．臨床心血管病雜志，2002，18(8)：375-380．

[22]GALLEGOS J E,ROSE A B.The enduring mystery of intron-mediated enhancement[J].Plant Science,2015,237(1):8-15.

[23]YAN S K,SONG Y H,ZHU W L,et al.Apolipoprotein B gene 3′VNTR polymorphism:association with plasma lipids and coronary heart disease in Han Chinese[J].Clin Chem Lab Med,2006,44(10):1199-1205.

[24]HONG S H,SONG J,KIM J Q.The haplotype analyses using multiple markers of the apolipoprotein B gene in patients with coronary artery disease[J].J Korean Med Sci,2001,16(6):719-724.

[25]SHAH A S,DAVIDSON W S,GAO Z Q,et al.Superiority of lipoprotein particle number to detect associations with arterial thickness and stiffness in obese youth with and without prediabetes[J].J Clin Lipidol,2016,10(3):610-618.

[26]SPOSITO A C,GONBERT S,TURPIN G,et al.Common promoter C516T polymorphism in the ApoB gene is an Independent predictor of carotid atherosclerotic disease in subjects presenting a broad range of plasma cholesterol levels[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2004,24(11):2192-2195.

[27]STAUFFER M E,WEISENFLUH L,MORRISON A.Association between triglycerides and cardiovascular events in primary populations:a meta-regression analysis and synthesis of evidence[J].Vasc Health Risk Manag,2013,9:671-680.

[28]STANIAK H L,FILHO W S,MINAME M H,et al.Association between postprandial triglycerides and coronary artery disease detected by coronary computed tomography angiography[J].Atherosclerosis,2014,233(2):381-386.

[29]GALLEGOS-ARREOLA M P,VALDEZ Y,ZUIGA-CORONA M,et al.Association between the Xba I polymorphism of APOB gene and plasma lipid level in Mexican patients with coronary artery disease[J].Asia Pac J Clin Nutr,2012,21(2):312-318.

[30]STONE N J,ROBINSON J G,LICHTENSTEIN A H,et al.2013 ACC/AHA guideline on the treatment of blood cholesterol to reduce atherosclerotic cardiovascular risk in adults a report of the American college of cardiology/American heart association task force on practice guidelines[J].J Am Coll Cardiol,2014,63(25):2889-2934.