噬菌蛭弧菌的裂解機(jī)制及其在水體監(jiān)控上的應(yīng)用

鄭美林 ，李璟 *，周雪 ，王利 ，魏勇 ，蒲又新

（1.成都理工大學(xué)環(huán)境學(xué)院，四川 成都 610059；2.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041；3.四川省畜牧科學(xué)研究院，四川 成都 610066）

噬菌蛭弧菌（Bdellovibrio bacteriovorus）是寄生于其他細(xì)菌并能導(dǎo)致其裂解的一類(lèi)革蘭氏陰性細(xì)菌。噬菌蛭弧菌以弧狀、桿狀為主，其菌體長(zhǎng)度為0.8～1.2μm，寬度為 0.25～0.40μm。首次由 Stolp和 Petzhold從菜豆葉燒病假單胞菌ATCC11355中發(fā)現(xiàn)[1]。噬菌蛭弧菌以捕食其他革蘭氏陰性菌為生，具有類(lèi)似于噬菌體噬菌作用的一類(lèi)寄生菌[2]，具有“寄生”和“裂解”這兩種獨(dú)特的生物學(xué)特性，能夠裂解許多致病菌。因此，在抗生素濫用存在一系列安全隱患的今天，將噬菌蛭弧菌研發(fā)為一種新型的安全、高效、環(huán)保的抗菌類(lèi)藥物已經(jīng)成為近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究熱點(diǎn)。

1 噬菌蛭弧菌對(duì)宿主菌的裂解機(jī)制

1.1 識(shí)別 攻擊階段（無(wú)復(fù)制發(fā)生）的噬菌蛭弧菌[3]在鞭毛波形運(yùn)動(dòng)下靠辨別宿主群產(chǎn)生的絲氨酸內(nèi)酯高速向宿主菌富集區(qū)域前進(jìn)，無(wú)鞭毛端與宿主菌接觸。噬菌蛭弧菌基因組中有6個(gè)成簇的運(yùn)動(dòng)與鞭毛合成基因。

1.2 吸附與穿入 單個(gè)噬菌蛭弧菌接觸并吸附宿主菌后，其他噬菌蛭弧菌便不能再吸附。吸附作用通常維持?jǐn)?shù)分鐘，侵入只需幾秒鐘。噬菌蛭弧菌吸附宿主細(xì)胞后幾分鐘內(nèi)就可破壞細(xì)胞壁，穿入宿主細(xì)胞，此時(shí)鞭毛消失，整個(gè)過(guò)程最長(zhǎng)為60min。特殊的鞭毛結(jié)構(gòu)提供主要?jiǎng)恿Γ沟檬删位【?00r/s以上的高轉(zhuǎn)速在宿主菌細(xì)胞壁上機(jī)械鉆孔，穿入細(xì)胞壁，頭部與宿主菌原生質(zhì)體連在一起，形成滲透孔，細(xì)胞內(nèi)外滲透壓平衡失調(diào)，原生質(zhì)體膨脹，于是噬菌蛭弧菌被動(dòng)進(jìn)入膨脹的細(xì)胞。

1.3 復(fù)制 絲狀的噬菌蛭弧菌細(xì)胞會(huì)長(zhǎng)到幾個(gè)普通噬菌蛭弧菌細(xì)胞的尺寸，后期形成膈將絲狀細(xì)胞分成奇數(shù)個(gè)同樣大小的子代細(xì)胞。噬菌蛭弧菌利用宿主DNA合成自身DNA，但宿主DNA總量通常小于噬菌蛭弧菌子代細(xì)胞的DNA總量，即噬菌蛭弧菌會(huì)合成大量核苷酸。

1.4 增殖與釋放 宿主細(xì)胞質(zhì)耗盡后，噬菌蛭弧菌分裂成子細(xì)胞并合成鞭毛，待生長(zhǎng)成熟后合成一種新的具有完全裂解修飾肽聚糖功能的酶，作用于肽聚糖中的氨基糖連接鍵。從而釋放子代蛭弧菌，尋找新宿主。單個(gè)噬菌蛭弧菌的生活周期會(huì)持續(xù)4～6h。噬菌蛭弧菌的水解酶在其進(jìn)入宿主細(xì)胞壁、降解宿主生物大分子聚合物以及裂解蛭質(zhì)體這3個(gè)階段都是至關(guān)重要的[3]，而蛋白酶和肽酶在噬菌蛭弧菌的生活周期中也十分重要。

2 在水體檢測(cè)方面的應(yīng)用

2.1 噬菌蛭弧菌作為水體檢測(cè)指標(biāo) 水體檢測(cè)的指標(biāo)多種多樣，不同水源有不同的檢測(cè)指標(biāo)，比如地表水監(jiān)測(cè)內(nèi)容可以是pH、糞大腸菌群、石油類(lèi)、硫化物等；地下水可以是pH、總硬度、溶解性總固體、陰離子表面活性劑、細(xì)菌總數(shù)及礦化度等。噬菌蛭弧菌普遍存在于土壤、污水、湖水、河水、井水及海水等環(huán)境中。目前許多研究并未在潔凈的水中發(fā)現(xiàn)噬菌蛭弧菌，反而在污染的水體中發(fā)現(xiàn)，且其數(shù)量隨著污染程度增加而增多。因此，許多學(xué)者提出可將噬菌蛭弧菌作為一個(gè)水體檢測(cè)指標(biāo)。

2.2 噬菌蛭弧菌作為河水污染指示菌 根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果，污染程度不同的河流段其噬菌蛭弧菌含量也有顯著差異（P＜0.05），噬菌蛭弧菌含量與污染程度呈正相關(guān)，噬菌蛭弧菌可以作為指示菌來(lái)檢測(cè)水體污染情況[5]。畢新萍等[6]采集了水庫(kù)、水塘、冰川、排污口、生活區(qū)、自來(lái)水廠(chǎng)等地的16份水樣，通過(guò)對(duì)噬菌斑的鑒定和水質(zhì)各項(xiàng)理化指標(biāo)的檢測(cè)，得出噬菌蛭弧菌的含量與水質(zhì)的潔凈程度有高度的正比關(guān)系。因此，可以用噬菌蛭弧菌的含量來(lái)判斷水體污染程度及生活飲用水是否符合衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)。另一方面，秦生巨[7]試驗(yàn)表明，添加了噬菌蛭弧菌的河水第5 d出現(xiàn)澄清趨勢(shì)，到48d時(shí)河水顯著澄清透明，而對(duì)照組仍處于渾濁狀態(tài)；進(jìn)一步檢查發(fā)現(xiàn)，相同時(shí)間內(nèi)加噬菌蛭弧菌的河水的濁度單位和生物耗氧量均比未加噬菌蛭弧菌的對(duì)照組下降顯著，且整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中pH、氧化物、總硬度、鈣、鎂的含量都發(fā)生了一系列改變，推測(cè)其與噬菌蛭弧菌凈化宿主菌的活動(dòng)有密切關(guān)系，故作者認(rèn)為噬菌蛭弧菌可作為水體檢測(cè)指標(biāo)。

3 在水體控制方面的應(yīng)用

3.1 對(duì)污水的凈化 研究表明，在水產(chǎn)養(yǎng)殖的早期使用噬菌蛭弧菌微生態(tài)制劑，能夠使池塘水體保持良好的生態(tài)環(huán)境，維持水體生態(tài)相對(duì)平衡，還能夠抑制藍(lán)藻生長(zhǎng)，防止水體惡化。四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院[8]對(duì)實(shí)驗(yàn)污水原液和加了噬菌蛭弧菌與滅活噬菌蛭弧菌的對(duì)照污水進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)，3d后，有噬菌蛭弧菌作用的污水中的細(xì)菌數(shù)比含滅活噬菌蛭弧菌的污水低。噬菌蛭弧菌對(duì)滅菌自來(lái)水、湖水及模擬自然條件下的河水中的沙門(mén)氏菌、大腸桿菌、霍亂弧菌、痢疾桿菌等病菌的清除作用很明顯，清除效率達(dá)90%以上，甚至100%。由此可見(jiàn)，噬菌蛭弧菌對(duì)高濃度的污染菌具有清除作用，說(shuō)明該菌對(duì)污水有一定的凈化作用。

3.2 調(diào)控水體pH值 pH值可以綜合反映水體的理化狀況。熊英等[9]選取兩個(gè)池塘連續(xù)3d潑灑噬菌蛭弧菌，之后每隔15d潑灑1次，對(duì)照塘不加噬菌蛭弧菌，然后在不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)定試驗(yàn)塘的pH值。結(jié)果表明，向水中潑灑噬菌蛭弧菌后第3d，對(duì)照塘的pH值略有升高，之后隨著向試驗(yàn)塘周期性地潑灑噬菌蛭弧菌，試驗(yàn)塘的pH值變化不大且趨于穩(wěn)定，但對(duì)照塘的pH值較試驗(yàn)塘變化幅度大。同樣，陳家長(zhǎng)[10]研究表明，在水產(chǎn)養(yǎng)殖池塘中添加噬菌蛭弧菌，能有效穩(wěn)定pH值。通過(guò)使用噬菌蛭弧菌來(lái)穩(wěn)定水體pH值，并在較短時(shí)間內(nèi)裂解弧菌、氣單胞菌、假單胞菌、沙門(mén)氏菌、志賀菌等常見(jiàn)病原菌，將這些細(xì)菌限制在較低的數(shù)量水平，可達(dá)到凈化水體、控制水質(zhì)的目的，具有十分重要的研究前景。

4 噬菌蛭弧菌的應(yīng)用展望

4.1 食品保鮮與防腐 在新鮮水果的殺菌和產(chǎn)品質(zhì)量提高方面，傳統(tǒng)的清洗殺菌手段不能保證食品安全。控制新鮮水果微生物污染目前最主要的方法仍是使用化學(xué)殺菌劑，但大多數(shù)化學(xué)殺菌劑有較高的殘留毒性，且降解期長(zhǎng)，具有致癌、致畸性，因此研究開(kāi)發(fā)毒性小、無(wú)污染、對(duì)人體無(wú)毒副作用的新型殺菌劑已是當(dāng)務(wù)之急，而噬菌蛭弧菌在這方面有著無(wú)限的應(yīng)用潛力。目前的理論都顯示噬菌蛭弧菌對(duì)動(dòng)物及人體無(wú)害，在大量的動(dòng)物毒性試驗(yàn)數(shù)據(jù)支撐下，可以將噬菌蛭弧菌制品真正廣泛應(yīng)用于食品加工領(lǐng)域，以代替防腐劑。

4.2 醫(yī)療領(lǐng)域的應(yīng)用 研究表明，噬菌蛭弧菌對(duì)真核細(xì)胞無(wú)裂解作用，許多致病菌是原核細(xì)胞，在醫(yī)療領(lǐng)域用噬菌蛭弧菌替代一些抗生素，可以緩解抗生素的濫用。Iebba等[11]研究表明，噬菌蛭弧菌在健康人腸道中的數(shù)量眾多，維持著腸道微生態(tài)系平衡，而在患炎癥性腸病、乳糜瀉和囊性纖維化病人腸道中的數(shù)量嚴(yán)重減少甚至消失，進(jìn)而導(dǎo)致腸道微生態(tài)系失衡。Loozen等[12]研究表明，噬菌蛭弧菌HD100可作為抑制口腔革蘭氏陰性菌的益生菌來(lái)預(yù)防牙周病。以上結(jié)果表明，噬菌蛭弧菌減少與人類(lèi)患病有關(guān)，該菌在調(diào)控人類(lèi)口腔、腸道等微生物類(lèi)群、維持生態(tài)平衡方面有重要作用。

4.3 水體治理 噬菌蛭弧菌能夠裂解水體中的有害細(xì)菌，對(duì)水體有一定的凈化作用。在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中使用噬菌蛭弧菌可保持塘水的穩(wěn)定，從而提高苗種的成活率和魚(yú)蝦的生長(zhǎng)速度。

5 噬菌蛭弧菌研究中存在的問(wèn)題

5.1 自然水體影響 自然條件下常看到噬菌蛭弧菌含量與細(xì)菌污染程度呈正相關(guān)，但其水體狀態(tài)比模擬條件下的水體狀態(tài)復(fù)雜而多變，其中噬菌蛭弧菌和宿主菌的相互關(guān)系取決于宿主菌群的組成、生理狀態(tài)、生長(zhǎng)速率以及溫度、膠體顆粒、水流速度等多種因素。

5.2 起效時(shí)間長(zhǎng) 噬菌蛭弧菌是一種細(xì)菌，需要一定的生長(zhǎng)周期，不能像抗生素或者其他類(lèi)化學(xué)藥物一樣迅速發(fā)揮效果。當(dāng)致病菌數(shù)量增長(zhǎng)到一定程度時(shí)，才有明顯而可觀(guān)的裂解效果。

5.3 清除不完全 有研究表明，即使噬菌蛭弧菌與宿主菌的濃度比例較高，也不易完全清除宿主菌，如何增強(qiáng)其裂解能力并使其在完全裂解宿主菌后再自行消亡也是目前尚未解決的問(wèn)題。

5.4 協(xié)同機(jī)制尚未明確 噬菌蛭弧菌種類(lèi)繁多，不同的噬菌蛭弧菌具有不同的裂解作用，在裂解致病宿主菌時(shí)，它們之間如何協(xié)同作用的具體機(jī)制尚不清楚。

5.5 噬菌蛭弧菌對(duì)抗生素的耐受性 目前世界范圍內(nèi)的抗生素濫用給自然界造成了嚴(yán)重污染，噬菌蛭弧菌同樣也受到影響，廣泛使用噬菌蛭弧菌裂解宿主菌時(shí)還應(yīng)該考慮提高其對(duì)抗生素的耐受性。