不同產地和不同年限黃芩HPLC指紋圖譜研究

田 甜，韓蕊蓮，梁宗鎖*

(1.浙江理工大學a生命科學學院，b建筑工程學院，浙江 杭州 310018； 2.中國科學院水利部水土保持研究所，陜西 楊凌 712100)

黃芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)是唇形科黃芩屬植物，以干燥根入藥，是我國常用的大宗藥材之一，具有瀉火解毒、清熱燥濕、止血安胎等功效[1]。黃芩含有多種化學成分，黃酮類是黃芩的有效成分，包括黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、千層紙素A等，其中黃芩苷是評價黃芩藥材質量的主要依據[2-4]。黃芩主產于河北、山西、內蒙古、陜西、山東等地，多為野生，以河北熱河野生黃芩為道地品種，現由于人工采挖較為頻繁，黃芩資源短缺，人工種植黃芩也越來越多，栽培黃芩已成為黃芩藥材的主要來源[5-6]。中藥指紋圖譜是一種從整體上對中藥進行鑒定和評價的技術，為中藥質量評價建立了重要的模式，已經成為國內外公認的控制中藥材和天然藥物質量最有效的方法，被更多人采納[7-8]。

我國種植黃芩的產地較多，生長環境及栽培方式也有差別。黃芩生長受這些因子影響，不同產地和不同生長年限的黃芩中黃酮類成分有較大差別，如何保證黃芩藥材質量成為當前待解決的問題。目前對于產地和生長年限對黃芩藥材化學成分和質量影響的報道較少，因此，本文收集到6個不同產地22批次黃芩藥材，采用HPLC檢測其有效成分[9-10]，建立了黃芩藥材的指紋圖譜，并通過相似性分析，對不同產地黃芩有效成分含量、產量進行比較分析，以確定不同產地黃芩最佳采收期，為黃芩藥材的質量評價提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器

電熱鼓風干燥箱GZX-9023MBE(上海博訊實業有限公司醫療設備廠)，50 g手提式高速萬能粉碎機DEF-50 A(溫嶺市林大機械有限公司)，標準檢驗篩(浙江上虞瑞志儀器廠)，電子天平(賽多利斯科學儀器北京有限公司)，數控超聲波清洗機KQ-500DE型(昆山市超聲儀器有限公司)，R3加熱水浴鍋和R3旋轉蒸發儀(瑞士BUCHI公司)，外循環水浴鍋(濟南海能儀器股份有限公司)，AP-9925真空泵(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)，移液器Eppendorf research plus(德國Eppendorf公司)，Waters2695高效液相色譜儀，Waters2998二極管陣列檢測儀，Empower3色譜分析軟件，Waters SunFireTMC18色譜柱(4.6×250 mm，5 μm)(美國Waters公司)。

1.1.2 試劑

丙酮(浙江漢諾化工科技有限公司)，色譜級甲醇(德國默克公司)，色譜級磷酸(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，超純水，蒸餾水。

1.1.3 對照品及樣品

對照品。黃芩苷對照品(批號SB8020，純度≥98%)、黃芩素對照品(批號SW8010，純度≥98%)、漢黃芩素對照品(批號SW8030，純度≥98%)均購自北京索萊寶科技有限公司，千層紙素A對照品(批號P0967，純度≥98%)購自北京博易匯科生物技術有限公司。

樣品。不同產地黃芩樣品的來源見表1，且經浙江理工大學生命科學學院生態學與植物學重點實驗室梁宗鎖教授鑒定所有樣品均為黃芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)正品。

表1 不同產地黃芩樣品的來源

1.2 方法

本試驗方法根據文獻[11]中的方法進行優化。

1.2.1 供試品溶液制備

將黃芩樣品于50 ℃烘箱干燥，粉碎，過40目尼龍篩(425 μm)。精密稱定樣品0.1 g置于25 mL容量瓶中，加入70%丙酮22.5 mL，于60 ℃下超聲60 min(頻率：20 kHz，功率：500 W)，冷卻后用70%丙酮定容至25 mL，過濾后精密吸取濾液5 mL于旋轉蒸發瓶中，濾液于60 ℃下旋轉蒸發至干后，用甲醇定容至10 mL，超聲溶解，即為供試品溶液。經0.22 μm微孔濾膜過濾后，即為待測樣品(每個樣品3個重復)。

1.2.2 HPLC條件

HPLC采用二次元梯度洗脫的方式，流動相為甲醇(A相)和0.22%磷酸水(B相)，梯度洗脫程序為：0～10 min，35%～45% A；10～15 min，45%～70% A；55～65 min，70%～35% A；檢測波長：274 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：25 ℃；進樣量：10 μL。

1.2.3 對照品溶液制備

精密稱取黃芩苷對照品0.002 99 g，黃芩素對照品0.001 2 g，漢黃芩素對照品0.000 4 g，千層紙素A對照品0.000 24 g，均置于25 mL容量瓶中用甲醇溶解，即為混合對照品溶液。經0.22 μm微孔濾膜過濾后，即為待測對照品。

1.2.4 線性關系考查

將1.2.3節中的混合對照品溶液0.5，2，5，10，20，30 μL，在1.2.2節HPLC條件下精密進樣，以對照品濃度(g·mL-1)為橫坐標(X軸)、色譜峰面積為縱坐標(Y軸)，分別計算黃芩苷對照品、黃芩素對照品、漢黃芩素對照品、千層紙素A對照品的線性回歸方程(表2)。

表2 黃芩中4種有效成分的線性回歸方程

1.2.5 方法學考查

穩定性實驗。取同一產地黃芩粉末，按照1.2.1節和1.2.2節的方法進行提取和檢測，分別在0、2、4、6、8、10、12、24、36、48、72 h檢測樣品色譜峰。結果表明，樣品各主要色譜峰的相對保留時間和峰面積的相對標準差(RSD)值均小于2%，符合指紋圖譜要求，穩定性較好。

精密度實驗。取同一產地黃芩粉末，按照1.2.1節和1.2.2節的方法進行提取和檢測，連續進樣6次，檢測樣品色譜峰。結果表明，樣品各主要色譜峰的相對保留時間和峰面積的RSD值均小于2%，符合指紋圖譜要求，精密度較好。

重復性試驗。 取同一產地黃芩粉末，稱取6份，制備6個供試品溶液，按照1.2.1節和1.2.2節的方法進行提取和檢測，檢測樣品色譜峰。結果表明，樣品各主要色譜峰的相對保留時間和峰面積的RSD值均小于2%，符合指紋圖譜要求，重復性較好。

1.2.6 中藥指紋圖譜建立

將22批次黃芩樣品的色譜峰導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2012版)”，對4個有效成分色譜峰進行多點校正，生成對照指紋圖譜。

1.2.7 相似性分析

將實驗數據導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2012版)”相似度計算軟件，進行相似度的評價分析。

2 結果與分析

2.1 HPLC對比圖

如圖1中A和B所示，樣品中4種成分(黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、千層紙素A)的出峰時間與標品中相應成分的出峰時間具有較好的擬合度。

2.2 不同產地黃芩樣品4種有效成分HPLC測定結果

將6個產地的22批次黃芩樣品按照1.2.1節和1.2.2節的方法進行提取和檢測，得到22批次黃芩樣品的高效液相色譜圖，根據峰面積和對照品的標準曲線來計算黃芩樣品中4種有效成分的含量，結果如表3所示。

a. 黃芩苷； b. 黃芩素；c. 漢黃芩素；d.千層紙素A圖1 黃芩根對照品(A)和樣品(B)的HPLC圖譜

表3 不同產地黃芩樣品4種有效成分含量的百分比

22批次黃芩樣品中均含有黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、千層紙素A 4種有效成分，但是每個樣品中4種成分含量差異較大。其中山東濰坊一年生黃芩苷含量最高，為21.13%±0.56%；山西長治二年生黃芩素、漢黃芩素、千層紙素A含量均為最高，分別為4.56%±0.40%、1.14%±0.10%、0.69%±0.05%；陜西商洛四年生黃芩苷含量最低，為11.06%±1.80%；內蒙古野生黃芩黃芩素含量最低，為1.09%±0.00%；河北熱河一年生漢黃芩素含量最低，為0.26%±0.07%；山東臨沂一年生千層紙素A含量最低，為0.13%±0.01%。

4種有效成分按照不同產地比較，如圖2所示，一年生黃芩中，山東濰坊黃芩苷含量最高，甘肅定西黃芩素、千層紙素A含量最高，陜西商洛漢黃芩素含量最高，二年生黃芩中：山東濰坊黃芩苷含量最高，山西長治黃芩素、漢黃芩素和千層紙素A含量最高；三年生黃芩中，陜西商洛黃芩苷含量最高，甘肅定西黃芩素和千層紙素A含量最高，山西長治漢黃芩素含量最高，野生黃芩中：山東沂蒙山黃芩苷含量最高，河北熱河黃芩素含量最高，山西長治漢黃芩素和千層紙素A含量最高。

圖2 相同產地不同年限黃芩中4種有效成分含量的差異

總黃酮含量分別按照不同年限來比較，如表2所示，甘肅定西一年生黃芩總黃酮含量最高，三年生次之，二年生最少；河北熱河一年生黃芩總黃酮含量最高，野生和三年生次之，二年生最少；內蒙古赤峰二年生黃芩總黃酮含量比野生的高；山東濰坊一年生黃芩總黃酮含量最高，臨沂一年生和沂蒙山野生次之，濰坊二年生黃芩總黃酮含量最低；山西長治二年生黃芩總黃酮含量最高，一、三年生次之，野生最低；陜西商洛三年生黃芩總黃酮含量最高，一年生和野生次之，二年生和四年生最低。

2.3 不同產地黃芩總黃酮產量

從圖3可以看出，隨著生長年限的增加，黃芩總黃酮產量呈上升趨勢。內蒙古赤峰野生黃芩總黃酮產量比二年生黃芩略高；山西長治、甘肅定西、山東和河北熱河產地的黃芩隨著年限增加，黃芩總黃酮產量也會增加；陜西商洛三年生黃芩總黃酮產量最高；總體看來，河北熱河野生黃芩中黃芩總黃酮產量最高，要比其他產地黃芩高一倍以上，品質最好。

圖3 不同產地不同年限黃芩中總黃酮產量的差異

2.4 黃芩樣品HPLC指紋圖譜

2.4.1 指紋圖譜建立

黃芩樣品指紋圖譜如圖4所示，將22個色譜峰進行比對之后，共有13個共有峰(圖5)，其中8號峰為黃芩苷，11號峰為黃芩素，12號峰為漢黃芩素，13號峰為千層紙素A。以8號峰作為參照峰，計算13個共有峰的相對保留時間，得出其RSD均小于1.5%(表4)。

圖4 不同產地黃芩樣品的指紋圖譜

圖5 22批次黃芩樣品13個共有峰色譜

表4 不同產地黃芩共有峰的相對保留時間 min

2.4.2 相似性

從表5數據結果可以看出，22批次黃芩樣品指紋圖譜的相似度較高，均在0.953%～0.999%。以夾角余弦系數作為相似度指標，13個共有峰相對峰面積作為基本數據，對22批次黃芩藥材進行相似性評價，結果列表6。

表6表明，22批次黃芩藥材與標準指紋圖譜之間的夾角余弦系數均在0.970%以上，與指紋圖譜相似度分析相似，并且以矢量法建立標準的指紋圖譜較能反應黃芩的質量。

表5 22個黃芩樣品指紋圖譜相似度分析

表6 不同產地黃芩共有峰相對峰面積

3 小結與討論

3.1 不同產地和不同生長年限黃芩有效成分差異

本文分析了不同產地和不同生長年限黃芩有效成分含量的差異。結果表明，22批樣品中，山東濰坊一年生黃芩苷含量最高，為21.13%±0.56%；陜西商洛四年生黃芩苷含量最低，為11.06%±1.80%；樣品均符合2015版《中國藥典》[1]規定：即，按干燥品算，黃芩苷(C21H18O11)含量不得少于9.0%。并且郭曉燕等[12]、李韋等[13]、周錫欽等[14]研究表明，黃芩藥材中黃芩苷的含量一般在10%～25%，本實驗的結果與這一規律一致。

不同產地黃芩受生長環境[15]、土壤[16]、水分[17]、施肥[18-19]及栽培方式[20]等多種因素的影響，黃芩的長勢、化學成分的組成及其含量也會有差別。本研究中一年生黃芩中山東濰坊產地總黃酮含量最高，二年生黃芩中山西長治產地總黃酮含量最高，三年生黃芩中陜西商洛產地總黃酮含量最高，野生黃芩中山東沂蒙山產地總黃酮含量最高。王磊等[21]、管仁偉等[22]研究發現不同產地黃芩的性狀、化學成分和質量存在差異。本實驗結果顯示，山東、陜西等道地產區黃芩品質較好。且黃芩品質受采收期影響，因此應因地適宜，根據當地條件選擇最佳的采收時間。

不同采收期的黃芩中黃酮類成分的種類與含量也有一定的差異[23]。本研究中同一產地一年生黃芩的黃芩苷含量普遍高于二年生、三年生和野生黃芩，說明隨著時間的增長，黃芩根中黃芩苷含量隨著時間的增長而降低。然而趙勝男等[24]研究發現一年生并不是黃芩的最佳采收期，因此本文結合黃芩根重，粗略估計出不同生長年限黃芩總黃酮產量。結果表明，三年生黃芩和野生黃芩總黃酮產量顯著高于一二年生黃芩總黃酮產量，其中河北熱河野生黃芩產量最高。由于野生黃芩生長時間過長，資源較少，也有文獻表明野生黃芩可以用人工栽培黃芩替代[25]，結合黃芩的產量和有效成分含量，建議三四年生的黃芩更適合采收加工。

3.2 黃芩有效成分指紋圖譜建立

中藥指紋圖譜的建立對于鑒別中藥品種和評價中藥質量有非常重要的意義，已經成為國內外公認的一種最有效的手段[26]，目前，丹參[27]、黃精[28]、酸棗[29]、三七[30]、烏藥[31]、秦艽[32]、熟地黃[33]、鐵皮石斛[34]、三葉青[35]等多種藥材的指紋圖譜已經建立。中藥指紋圖譜通過歐氏距離、夾角余弦和相似系數等作為評價指標來反應樣品之間的相似性，能夠從整體上更好的評價藥材質量[7]。

本實驗在6個產地22批次樣品的基礎上建立黃芩指紋圖譜。結果表明，22批次不同產地樣品共有13個共有峰，且共有峰相對保留時間均小于1.5%，說明本方法色譜峰分離度較好，特征峰明顯；與此同時，采用中藥指紋圖譜相似度和夾角余弦系數作為評價指標來評價各樣品之間的相似性，樣品相似度分別大于95.0%和97.0%，說明本次樣品之間一致性較好，無異常樣品。本研究采用HPLC-中藥指紋圖譜技術結合多成分定量分析的方法，可以更可靠地用于中藥質量評價[36]，對于不同產地黃芩質量評價有了更全面的分析，有助于提高黃芩藥材的研究水平和質量控制水平。

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